Título: O papel dos corpúsculos lipídicos durante a infecção por Salmonela typhimurium

Aluno: Ellen Kiarely de Souza 

Orientador(es): Profa. Patrícia T. Bozza

Salmonela é uma bactéria Gram-negativa, sendo o agente etiológico da salmonelose. A Salmonelose é uma das principais zoonoses para saúde pública em todo o mundo, caracterizada por sua endemicidade, alta morbidade e, principalmente, pela dificuldade de adoção de medidas de controle. Após sua internalização, a Salmonela, manipula diversos mecanismos do hospedeiro, principalmente por meio da ativação do sistema secretor do tipo III (T3SS), incluindo a modificação do metabolismo lipídico do hospedeiro e o acúmulo de corpúsculos lipídicos (CL). Os CLs são organelas ricas em lipídios compostas por lipídios neutros, podendo ser encontrados virtualmente em todos os tipos de células. Esses também estão envolvidos no controle e na síntese de mediadores inflamatórios lipídicos. Os CLs também estão envolvidos na patogênese de vários patógenos. A participação desses na relação patógeno-hospedeiro já foi observada na infecção por vírus, bactérias, parasitas e protozoários. Diante do exposto,neste trabalho fomos investigar a participação dos corpúsculos lipídicos na infecção pela Salmonela enterica sorovar Typhimurium e seu envolvimento na patogenicidade bacteriana Nós demonstramos que a S. Typhimurium induziu um aumento rápido, tempodependente de corpúsculos lípidicos em macrófagos. Foi demonstrado que a biogênese de CLs depende da viabilidade da Salmonela e da atividade do sistema secretor do tipo III (T3SS) relacionada ao SPI1, com a participação da sinalização dos receptores Toll- Like (TLRs). Também observamos que o acúmulo de CLs ocorre por meio da sinalizaçãodependente de TLR2 e é contra-regulado por TLR4. Por último, a modulação farmacológica da formação de CLs pela inibição da diacilglicerol O-aciltransferase 1 (DGAT1) e da fosfolipase A2 citosólica (cPLA2) reduziu significativamente a proliferação bacteriana intracelular e prejudicou a síntese de prostaglandina E2 (PGE2). Coletivamente, nossos dados sugerem o papel dos CLs na sobrevivência intracelular de S. Typhimurium e na replicação em macrófagos. Este conjunto de dados fornece novas perspectivas para futuras investigações sobre CLs na interação patógeno-hospedeiro.

Palavras-chave: Corpúsculos lipídicos; Salmonela typhimurium; TLRs; PGE2

The Zika virus (ZIKV) is a member of Flaviviridae family firstly isolated in 1947 in Uganda, which diverged in two strains, the African and Asian, and the last one is related with the epidemic of an exanthematic disease in the Americas in 2015. In adults, ZIKV infection is usually asymptomatic, but in rare cases it leads to the inflammation of the central nervous system or Guillain-Barré syndrome. In these severe cases, the pattern of brain inflammation and infection is not known. In addition, the protective adaptive immune response against ZIKV has been attributed to CD8+ T lymphocytes and neutralizing antibodies, while the role of CD4+ T lymphocytes has not yet been clarified. We aimed to study here the role of CD4+ T lymphocytes as well as the dynamics of brain infection and inflammation during ZIKV infection. Four-week-old mice deficient in type I interferon receptor (Ifnar1-/-) were infected with ZIKV Asian (PE243) or African (MR766) lineages (2 × 105 PFU, i.v.) and evaluated for the adaptive immune response in the spleen and the inflammation and infection of the brain. Infection of the Ifnar1-/- mouse with PE243 led to the activation of protective T CD4+ , T CD8+ and B lymphocytes, in addition to low inflammation and presence of infective viral particles in the brain. On the other side, infection with MR766 as lethal and associated with low activation of T lymphocytes and the high presence of the virus and CD8+ T lymphocytes and monocytes infiltrate in the brain. The adoptive transfer of CD4+ T lymphocytes from PE243-infected mice was able to limit the presence of the virus in the brain of Ifnar1-/- mice infected with MR766, thus protecting from lethal infection. CD4+ T lymphocytes and IFNγ were shown to be critical by inducing ZIKV neutralizing antibodies IgG anti-ZIKV. Although brain CD206hi macrophages are the main cells infected with ZIKV before massive brain inflammation, depletion of these cells did not alter the presence of leukocytes in the brain of the animal infected with MR766. We concluded here that CD4+ T lymphocytes and IFNγ are crucial in the protection against ZIKV mediated by neutralizing antibodies, preventing against viral presence in the brain and lethal infection. Keywords: ZIKV; CD4+ T lymphocytes; antibodies; interferon γ; inflammation.

Keywords: Lipid metabolism; Salmonella typhimurium;TLRs; PGE2

Título: Papel Diferencial dos Receptores de Eferocitose MERTK e AXL na Homeostase Pulmonar e Silicose

Aluno:  Kamila Guimaraes Pinto

Orientador(es): Profa. Alessandra D. Almeida Filardy, Profa. Marcela Lopes

A fagocitose de células apoptóticas ou eferocitose é fundamental para regular a homeostase e a inflamação, principalmente em um ambiente com alta renovação celular e colonizado por microbiota, como as mucosas pulmonares. A família de receptores TAM (Tyro3, Axl e MerTk) medeiam a eferocitose e inibem as vias pró-inflamatórias através da ligação do Gas6 ou Proteína S à fosfatidilserina nas células apoptóticas. Neste estudo, nós investigamos como MerTk e Axl regulam a homeostase pulmonar e a silicose. Durante a homeostase, as células pulmonares e macrófagos alveolares (AMs) de camundongos selvagens (WT) mostraram alta expressão de Axl, MerTk e Gas6 por RT-qPCR. BALFs de camundongos Axl-/- e MerTk-/- apresentaram níveis reduzidos de TGF-b e IL-10 e elevados de óxido nítrico (NO), em comparação aos de camundongos WT. BALFs de ambos os camundongos Axl-/- e MerTk-/- apresentaram aumentado número de células das vias aéreas e uma maior frequência e número de AMs e neutrófilos foi encontrada nos BALFs de camundongos MerTk-/- em comparação com camundongos Axl-/- ou WT. Pulmões de camundongos MerTk-/- apresentaram mais células totais pulmonares, maior expressão de CXCL1, CXCL2, TNF-a e IL-6, maior frequência e número de AMs, monócitos e neutrófilos, estrutura pulmonar prejudicada e maior número de AMs MHCII+ em comparação com camundongos Axl-/- ou WT. Ainda, AMs de camundongos Axl-/- regularam positivamente o receptor MerTk, sugerindo um papel importante de MerTk na regulação da homeostase da mucosa pulmonar. Durante a silicose, encontramos maior mortalidade em camundongos SIL-Axl em comparação com o grupo SIL-MerTk e SILWT. Três dias pós exposição à sílica, camundongos SIL-WT e SIL-Axl apresentaram diminuição da frequência respiratória se comparados aos seus grupos PBS e sete dias pós instilações camundongos SIL-Axl apresentaram aumento na resistência pulmonar se comparados a camundongos SIL-WT. BALFs e pulmões de camundongos SIL-Axl e SILMerTk apresentaram maior recrutamento celular em comparação com seus grupos PBS, no entanto, o número de células pulmonares totais foi comparativamente ao WT, ainda mais expressivo em SIL-Axl. Especificamente, BALFs e pulmões de todos os grupos expostos à sílica apresentaram maior frequência de neutrófilos e níveis mais elevados de CXCL1 em comparação com seus grupos PBS. No entanto, SIL-Axl apresentou números mais elevados de AMs, neutrófilos e monócitos, maiores níveis de CXCL1, TGF-b e níveis mais baixos de IL-10 e TNF-a em comparação com os grupos SIL-MerTk e/ou SIL-WT. Camundongos SIL-Axl ainda apresentaram um maior número de AMs MHCII+CD206+ e número menor de AMs CD206+ se comparados aos AMs do grupo SIL-WT. Finalmente, observamos que camundongos SIL-WT e SIL-MerTk regularam positivamente o mRNA para o receptor Axl após exposição à sílica em comparação com camundongos do grupo SIL-Axl. Coletivamente, nossos dados sugerem que os receptores MerTk e Axl são dedicados a manter a homeostase/tolerância e controlar a silicose, respectivamente, apontando que essas diferenças funcionais devem ser consideradas no desenho e aplicação de terapias direcionadas a esses receptores. 

Palavras-chave:  Receptores TAM; macrófago alveolar; neutrófilos; inflamação pulmonar

The phagocytosis of apoptotic cells or efferocytosis is paramount to regulate homeostasis and inflammation, particularly in an environment with high cell turnover and colonized by microbiota, such as the lung mucosae. The TAM receptor family (Tyro3, Axl and MerTk) mediates efferocytosis and inhibits pro-inflammatory pathways through Gas6 or Protein S binding to phosphatidylserine on apoptotic cells. Here we investigated how MerTk and Axl regulate lung homeostasis and silicosis. During homeostasis, lung cells and alveolar macrophages (AMs) from wild-type (WT) mice showed high expression of Axl, MerTk, and Gas6 by RT-qPCR. BALFs from Axl-/- and MerTk-/-mice had less TGF-b and IL-10, and higher levels of nitric oxide (NO) compared to WT mice. BALFs from Axl-/- and MerTk-/- mice had higher airway total cells number compared to WT mice, however only BALFs from MerTk-/- mice had a higher frequency and number of AMs and neutrophils compared to Axl-/- or WT mice. Lungs from MerTk-/- mice had more lung total cells, higher expression of CXCL1, CXCL2, TNF-a, and IL-6, and enhanced frequency and number of AMs, monocytes, and neutrophils, impaired lung parenchyma structure, and higher number of MHCII+ AMs compared to Axl-/- or WT mice. Furthermore, we found an upregulation of MerTk in Axl-/- AMs, suggesting an important role of MerTk in regulating the homeostasis of pulmonary mucosa. During silicosis, we found higher mortality in SIL-Axl compared to the SIL-MerTk or SIL-WT group. Three days after silica exposure, SIL-WT and SIL-Axl mice showed a drecrease in respiratory frequency compared to their PBS groups, and seven days post silica instillation, SIL-Axl showed an increase in lung resistance compared to SIL-WT mice. BALFs and lungs from SIL-Axl and SIL-MerTk had more cells compared to its PBS groups, but SIL-Axl had even more compared to the SIL-MerTk or SIL-WT group. Particularly, BALFs and lungs from all silica exposed groups had enhanced frequency of neutrophils and higher levels of CXCL1 compared to its PBS groups. However, SIL-Axl had greater numbers of AMs, neutrophils and monocytes, higher levels of CXCL1, TGF-b, and lower levels of IL-10 and TNF-a compared to the SIL-MerTk and/or SIL-WT groups. Also, SIL-Axl mice had a higher number of MHCII+CD206+ AMs and lower number of CD206+ AMs compared to SIL-WT AMs. Finally, we found that both SIL-WT and SIL-MerTk upregulated mRNA for Axl post silica exposure compared to the SIL-Axl group. Collectively, our data suggest that MerTk and Axl contribute to maintaining homeostasis/tolerance and control inflammation in the lungs, respectively, pointing out that these functional differences must be considered in the design and application of TAM-targeted therapy.

Keywords:  TAM receptors; alveolar macrophages; neutrophils; lung inflammation

Título: P62, Um Regulador da Resposta Celular à Infecção por Listeria monocytogenes

Aluno: Mariana da Silva Siqueira

Orientador(es): Prof. Leonardo Travassos, Profa. Leticia Carneiro

Agregados de proteínas ubiquitinadas, denominados ALIS, são formados de forma transiente em diversos tipos celulares após exposição à estímulos estressores como o estresse oxidativo e privação nutricional, ou a componentes microbianos, como LPS.  Outras proteínas também se encontram nestas estruturas, dentre elas p62, a qual é importante para sua formação e seu direcionamento para a autofagia, e LC3, que participa da via de degradação autofágica. No entanto, este fenômeno ainda está longe de ser compreendido e há pouco conhecimento sobre os mecanismos de indução de ALIS durante um contexto de infecção por patógenos bacterianos, principalmente por bactérias gram-positivas, como Listeria monocytogenes. Neste trabalho, demonstramos a formação de ALIS após a infecção de BMDMs por L. monocytogenes 10403S selvagem e com L. monocytogenes deficiente em listeriolisina O (LLO), cepa que apresenta um comprometimento no escape do vacúolo de internalização para o citosol. Ao contrário da cepa selvagem, a indução de ALIS pela cepa deficiente em LLO é dependente de ROS e ocorre mais tardiamente, sugerindo que a indução de ALIS por esta cepa ocorre através de uma via de sinalização diferente. Nós também investigamos o envolvimento da xenofagia como mecanismo celular de defesa contra a infecção por L. monocytogenes.  A infecção de macrófagos e fibroblastos com esta bactéria leva a indução de xenofagia nestas células. Devido a divergências na literatura com relação a xenofagia de Listeria entre os tipos celulares, protocolos de crescimento bacteriano e as cepas de Listeria utilizadas nestes estudos, nós realizamos a caracterização da xenofagia de L. monocytogenes em diferentes tipos celulares e comparamos a xenofagia de L. monocytogenes selvagem com a cepa deficiente em ActA, cujo escape da xenofagia é comprometido. Concluímos que: o perfil de indução ou não de xenofagia varia de acordo com o modelo celular utilizado no estudo; a temperatura de cultivo de L. monocytogenes pode impactar o reconhecimento da bactéria pelo maquinário autofágico; e a expressão de ActA por L. monocytogenes leva a um menor reconhecimento da bactéria pelo maquinário autofágico em células RAW 264.7 e MEFs. Alem disso, evidenciamos que fosforilação do resíduo S409 do domínio UBA de p62, promovida por ULK1, leva ao aumento da afinidade de p62 por proteínas ubiquitinadas em MEFs. Ainda, demonstramos que ULK1 e a fosforilação do resíduo S409 de p62 estão envolvidos no processo de reconhecimento de Listeria por p62 e ubiquitina em MEFs infectadas. Sendo assim, ULK1 e a fosforilação do resíduo S409 de p62 podem estar envolvidos e auxiliar na xenofagia de L. monocytogenes. 

Palavras-chave: ALIS, L. monocytogenes, xenofagia, ULK1, p62, ubiquitina

Ubiquitinated protein aggregates, known as ALIS, are transiently formed in different cell types in response to oxidative stress, starvation and a variety of microbial products, such as LPS. Other proteins, like p62, are also located in these structures and involved in their formation and targeting to autophagy. Another protein located in ALIS is LC3, which is involved in their autophagic degradation. However, the role of ALIS is still far from being fully understood and there is little knowledge about the mechanisms of ALIS induction during an infection context by bacterial pathogens, especially gram-positive bacteria, like Listeria monocytogenes. In this study, we demonstrate ALIS formation upon BMDMs infection by L. monocytogenes wild-type and listeriolisin O (LLO) knockout, which shows a compromised escape from the internalization vacuole to the cytosol. However, we demonstrate that, unlike the wild-type strain, ALIS induction by the LLO-deficient strain is ROS-dependent and its formation occurs at later time-points, suggesting that ALIS induction by this strain occurs through a different signaling pathway. Another mechanism that plays a role in innate immunity and is involved in the defense against L. monocytogenes infection is xenophagy. Macrophages and fibroblasts infection with this bacteria triggers xenophagy in these cells. Due to divergences in the Listeria xenophagy literature and the differences between cell types, bacterial growth conditions and Listeria strains used in different studies, we characterized L. monocytogenes xenophagy in different cell types and compared the xenophagy between wild-type and ActA deficient strain, whose escape from xenophagy is compromised. We conclude that: the profile of xenophagy induction or not, varies according to the cell model; the temperature of L. monocytogenes growth can impact the recognition of the bacteria by autophagic machinery; and L. monocytogenes expressing ActA leads to less recognition of the bacteria by the autophagic machinery in RAW 264.7 and MEFs cells. In addition, little is known about the molecular mechanisms involved in this process, which is important for controlling bacterium replication. p62 UBA domain phosphorylation of the S409 residue, promoted by ULK1, leads to an increased affinity of p62 for ubiquitinated proteins. Here, we demonstrate that ULK1 and the phosphorylation of p62 S409 residue are involved in the process of Listeria recognition by p62 and ubiquitin in infected MEFs. Thus, ULK1 and the phosphorylation of p62 S409 residue may be involved and assist L. monocytogenes xenophagy.

Keywords: ALIS, L. monocytogenes, xenophagy, ULK1, p62, ubiquitin

Título: Papel do Imunoproteassoma no Dano Muscular Induzido por Alfavírus Artriogênicos

Aluno: Rômulo Leão Silva Neris

Orientador(es): Profa. Iranaia Assunção Miranda

Mayaro e Chikungunya são membros da família Togaviridae, do gênero alphavirus. Enquanto o Mayaro está restrito à região da bacia Amazônica, Chikungunya circula em todo o globo com surtos principalmente nas regiões tropicais (de maior abundância do vetor). Desde sua introdução no Brasil em 2015, houveram mais de 600 mil casos prováveis em todo o território nacional. Mayaro e Chikungunya causam uma doença febril aguda, auto-limitada, caracterizada por cansaço, astenia, febre, eritema e intensa dor articular e muscular com comprometimento motor. Nessas doenças, após a resolução do quadro febril, 7-14 dias após o início dos sintomas, há cronificação da dor articular e muscular na maioria dos indivíduos por anos após o fim da viremia. Os mecanismos de cronificação da miosite durante essas infecções ainda não foi totalmente elucidado, mas achados sugerem semelhança com miopatias inflamatórias autoimunes. Em biópsias de músculo de ambos os casos encontramos níveis elevados de IFNγ e TNF, bem como um elevado número de macrófagos, linfócitos CD8+ e desarranjo da estrutura muscular acompanhada de atrofia. Em miopatias autoimunes, o complexo imunoproteassoma (IP) desempenha um papel chave na desregulação da homeostase proteica e subsequente ativação de células do infiltrado muscular. Sabe-se que em modelo murino de CHIKV, transcritos de subunidades do IP permanecem elevadas por um longo período no tecido muscular. Neste trabalho avaliamos o envolvimento da expressão e atividade do IP na miosite causada por MAYV e CHIKV. Animais infectados apresentam aumento da expressão dos componentes do IP de maneira concomitante com o aumento da viremia e o bloqueio farmacológico de β1i aumenta a carga viral no tecido bem como reduz a sobrevivência dos animais, enquanto β5i está associada ao controle do edema de pata. Em modelo celular macrófagos são capazes de modular a expressão de IP ao serem expostos à MAYV e CHIKV, mas não são suscetíveis à infecção. Adicionalmente, apesar de mioblastos e miotubos serem suscetíveis à infecção por CHIKV e MAYV, apenas mioblastos são capazes de regular positivamente a expressão do IP ao serem estimulados com IFNγ. Essas células são fundamentais para a formação de novas fibras no tecido lesionado pela infecção, e aqui demonstramos que a sua sobrevivência durante a infecção depende diretamente da atividade de IP. Juntos, esses resultados sugerem que o IP pode ser uma estrutura fundamental na busca de estratégias para a compreensão e tratamento da inflamação crônica causada por alfavírus.

Palavras-chave: Alfavirus;  Chikungunya; Mayaro; Miosite; Imunoproteassoma

Ubiquitinated protein aggregates, known as ALIS, are transiently formed in different cell types in response to oxidative stress, starvation and a variety of microbial products, such as LPS. Other proteins, like p62, are also located in these structures and involved in their formation and targeting to autophagy. Another protein located in ALIS is LC3, which is involved in their autophagic degradation. However, the role of ALIS is still far from being fully understood and there is little knowledge about the mechanisms of ALIS induction during an infection context by bacterial pathogens, especially gram-positive bacteria, like Listeria monocytogenes. In this study, we demonstrate ALIS formation upon BMDMs infection by L. monocytogenes wild-type and listeriolisin O (LLO) knockout, which shows a compromised escape from the internalization vacuole to the cytosol. However, we demonstrate that, unlike the wild-type strain, ALIS induction by the LLO-deficient strain is ROS-dependent and its formation occurs at later time-points, suggesting that ALIS induction by this strain occurs through a different signaling pathway. Another mechanism that plays a role in innate immunity and is involved in the defense against L. monocytogenes infection is xenophagy. Macrophages and fibroblasts infection with this bacteria triggers xenophagy in these cells. Due to divergences in the Listeria xenophagy literature and the differences between cell types, bacterial growth conditions and Listeria strains used in different studies, we characterized L. monocytogenes xenophagy in different cell types and compared the xenophagy between wild-type and ActA deficient strain, whose escape from xenophagy is compromised. We conclude that: the profile of xenophagy induction or not, varies according to the cell model; the temperature of L. monocytogenes growth can impact the recognition of the bacteria by autophagic machinery; and L. monocytogenes expressing ActA leads to less recognition of the bacteria by the autophagic machinery in RAW 264.7 and MEFs cells. In addition, little is known about the molecular mechanisms involved in this process, which is important for controlling bacterium replication. p62 UBA domain phosphorylation of the S409 residue, promoted by ULK1, leads to an increased affinity of p62 for ubiquitinated proteins. Here, we demonstrate that ULK1 and the phosphorylation of p62 S409 residue are involved in the process of Listeria recognition by p62 and ubiquitin in infected MEFs. Thus, ULK1 and the phosphorylation of p62 S409 residue may be involved and assist L. monocytogenes xenophagy.

Keywords: Alfavirus;  Chikungunya; Mayaro; myositis; Imunoproteasome

Título: Estudo da imunidade inata durante a infecção pelo HTLV1: caracterização molecular e funcional de monócitos e macrófagos.

Aluno: Sabrina Pires Maciel

Orientador(es): Profa. Juliana Echevarria Lima, Profa. Renata de Meirelles Santos Pereira

O vírus linfotrópico para células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus associado à mielopatia/paraparesia espástica tropical (MAH/PET). A MAH/PET é uma doença inflamatória crônica, caracterizada pela infiltração de leucócitos na medula espinhal, causando degeneração e perda da capacidade motora a longo prazo. Embora os linfócitos T sejam os principais alvos do HTLV-1, células como monócitos e macrófagos podem ser infectadas, além de estarem sujeitas ao ambiente inflamatório induzido pelo vírus, podendo sofrer alterações gênicas que afetem suas funções. Enquanto a imunidade adaptativa é bem estudada, pouco se sabe sobre a imunidade inata no desenvolvimento da MAH/PET. No presente trabalho, analisamos o perfil de monócitos de doadores infectados assintomáticos e portadores da MAH/PET e observamos uma redução significativa da subpopulação clássica (CD16- ) em doadores infectados, enquanto a subpopulação intermediária (CD16+ ) aumentou significativamente nos portadores da MAH/PET, sugerindo a resposta inflamatória nesses indivíduos. Esses achados foram corroborados em nossas análises de expressão gênica in silico. Além disso, demonstramos a perda da expressão de genes importantes para a resposta inflamatória e a conservação da assinatura antiviral durante a MAH/PET, representada por genes estimulados pelo Interferon (ISGs). Observamos também a ativação e diferenciação de monócitos de linhagem (THP-1) em macrófagos do tipo M1 após o co-cultivo com linhagem de linfócitos infectados pelo HTLV-1 (MT-2), caracterizados pela maior expressão de genes pró-inflamatórios e antivirais, além da liberação de citocinas pró-inflamatórias. As alterações observadas in vitro ocorrem de forma independente de contato.

Palavras-chave:  HTLV-1, monócitos, macrófagos, inflamação

The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus associated with a myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). HAM/TSP is a chronic inflammatory disease characterized by leukocytes infiltration into the spinal cord, causing degeneration and loss of motor capacity. Although T lymphocytes are the main target of HTLV-1, cells such as monocytes and macrophages can be infected, in addition to being exposed to the inflammatory environment induced by the virus, and may undergo molecular changes that affect their functions. While adaptive immunity is well studied, little is known about innate immunity during the HAM/TSP development. In the present study, we analyzed monocyte profile of asymptomatic infected donors and MAH/PET carriers and observed a significant reduction of the classic subpopulation (CD16- ) in infected donors, while the intermediate subpopulation (CD16+ ) significantly increased in MAH/PET carriers, suggesting an inflammatory response in these individuals. These findings were corroborated by our in-silico gene expression analysis. In addition, we demonstrated the loss of important gene expression for the inflammatory response and the conservation of antiviral signature during the HAM/TSP, represented by interferon-stimulated genes (ISGs). We also observed activation and differentiation of THP-1 monocytes cell line into M1 type macrophages after co-culture with HTLV-1-infected lymphocyte cell line (MT-2), characterized by increased expression of pro-inflammatory and antiviral genes, in addition to release of proinflammatory cytokines. The changes observed in vitro occur regardless cell-cell contact.

Keywords:  HTLV-1; monocytes; macrophages; inflammation

Título: Mecanismos celulares e moleculares envolvidos no reconhecimento imune inato do fungo patogênico Scedosporium apiospermum

Aluno: Yasmin Aurora Vieira Braga

Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo

As infecções fúngicas invasivas tem aumentado nas últimas décadas, representando uma importante causa de mortalidade em indivíduos imunossuprimidos. Scedosporium apiospermum é um fungo oportunista causador de infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos, sendo, além disso, um importante agente causador de micetomas micóticos, condição que acomete indivíduos imunocompetentes. S. apiospermum é amplamente distribuído na natureza, encontrado principalmente como saprófita de águas de rios, solo, estrumes, lamas de esgoto e pântano. Sabe-se que receptores da imunidade inata desempenham um papel essencial no reconhecimento imune inato de fungos patogênicos. TLR2, TLR4 e Dectin-1 estão envolvidos na indução da produção de mediadores inflamatórios em resposta a fungos patogênicos. Além disso, o reconhecimento de fungos é capaz de ativar o inflamassoma, promovendo a produção de IL-1β e ativação de caspase-1 por um mecanismo mediado por NLRP3, ou ainda por mecanismos independentes de NLRP3 e dependentes da caspase-8, AIM2, ou ativação constitutiva da caspase-1. Contudo, o papel e a contribuição de diversos receptores da imunidade inata no reconhecimento e imunidade à infecção pelo S. apiospermum são largamente desconhecidos. Assim, investigamos o papel do receptor de β-glucanas, Dectin-1, no reconhecimento imune inato de S. apiospermum. Nossos resultados demonstram que o reconhecimento de conídios de S. apiospermum por Dectin-1 promove a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a fagocitose requer o reconhecimento mediado por Dectin-1 por macrófagos e células mieloides, a atividade fungicida de macrófagos peritoneais não requer o reconhecimento mediado por Dectin-1. O processo de germinação de conídios começa em torno de 6h e 9h, completando a morfogênese para diferenciação em hifas no tempo de 24h. Os conídios em repouso apresentaram baixa ligação à Dectin-1 Fc, sendo esta aumentada em 6h de germinação, atingindo um máximo de ligação em 9h. A liberação de IL-1β em resposta a S. apiospermum necessitou da ativação do inflamassoma dependente de NLRP3/caspase-1. Em um modelo experimental de infecção dérmica por inoculação de S. apiospermum, Dectin1 é necessária para o controle da lesão durante a infecção. Nossos resultados demonstram que o receptor de β-glucanas, Dectin-1, desempenha um papel essencial no reconhecimento do fungo patogênico Scedosporium apiospermum. Deste modo, nossos resultados trazem uma contribuição importante para a compreensão das infecções causadas por esse fungo.

Palavras-chave: Scedosporium apiospermum; Reconhecimento imune inato; Inflamossomo; Dectin-1

Invasive fungal infections have increased in the last decades, representing an important cause of mortality and morbidity in immunosuppressed individuals. Scedosporium apiospermum is an opportunistic fungus that causes invasive infections in immunocompromised individuals, being also a relevant causative agent of mycetomas, a condition that affects immunocompetent individuals. S. apiospermum is widely distributed in nature, mainly found as saprophyte of rivers, soil, manures, sewage sludge and marshes. It is known that innate immunity receptors play an essential role in the innate immune recognition of pathogenic fungi. TLR2, TLR4 and Dectin-1 are involved in the production of inflammatory mediators in response to pathogenic fungi. In addition, fungal recognition is capable of activating the inflammasome, promoting the production of IL-1β and activation of caspase-1 by an NLRP3-mediated mechanism, or by NLRP3 independent mechanisms involving caspase-8 activation, AIM2 or constitutive activation of caspase-1. However, the role and contribution of various receptors of innate immunity in the recognition and immunity to S. apiospermum infection are largely unknown. Thus, we investigated the role of the β-glucan receptor, Dectin-1, in the innate immune recognition of S, apiospermum. Our results demonstrate that the recognition of S., apiospermum conidia by Dectin-1 the release of pro-inflammatory cytokines and phagocytosis by macrophages requires Dectin-1-mediated recognition. The fungicidal activity of peritoneal macrophages does not require Dectin-1 mediated recognition. The conidial germination begins around 6h and 9h, completing morphogenesis for differentiation in hyphae at 24h. At rest, conidia had a low binding to Dectin-1 Fc and Dectin-1 Fc binding was increased after 6h germination reaching a maximum binding in 9h. Release of IL-1β in response to S. apiospermum required recognition mediated by Dectin-1 and NLRP3/caspase-1 activation. In an experimental model of skin infection by inoculation of S. apiospermum, Dectin-1 is required for the control of the lesion during infection, but not caspase-1. Our results demonstrate that the β-glucan Dectin1 receptor plays an essential role in the recognition of the pathogenic fungus Scedosporium apiospermum. Thus, our results make an important contribution to understanding the infections caused by S. apiospermum.

Keywords: Scedosporium apiospermum; immune recognition;Inflamosmome;Dectin-1.

Título: Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) induzidas por laminina, fibronectina e colágeno isoladamente ou em associação com promastigotas de Leishmania amazonenses
Aluno: Gustavo da Silva Oliveira
Orientador(es): Prof. Elvira M. Saraiva

Diferentes estímulos recrutam neutrófilos (Nθ) da corrente sanguínea, que migram através do endotélio atingindo o tecido, onde desempenham mecanismos microbicidas como fagocitose, degranulação e a liberação das armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Essas etapas ocorrem em íntimo contato com proteínas da membrana basal (BM), matriz extracelular (MEC), onde as lamininas, fibronectina e colágeno são abundantes. Aqui, investigamos as interações entre Nθs e diferentes isoformas de laminina (LM), fibronectina e colágeno analisando a liberação das NETs. Nossos resultados demonstraram que Nθs estimulados com as LM-111, 211, 332, 411, 421 e 511, liberaram NETs. O mesmo aconteceu quando Nθs interagiram com LM 111, 411 e 511 polimerizadas. NETs liberadas por LM foram parcialmente inibidas pelo pré-tratamento dos Nθs com o anticorpo anti-integrina α6, redução de 37%, 32% e 35% quando estimulados com LM-111, -411 e -511, respectivamente. A liberação das NETs por LM-511 ocorreu de forma dependente das espécies reativas de óxigênio (ERO), enquanto a liberação induzida pela LM-411 foi independente de ERO. Além disso, as NETs liberadas pelas LMs foram dependentes da elastase e da peptidilarginina deiminase (PAD)-4, enzimas que participam do processo de descondensação da cromatina. Mostramos que LM-111, 411 e -511apresentam efeito sinérgico sobre as NETs induzidas por promastigotas de Leishmania amazonensis. NETs induzidas por LM-511 apresentam papel leishmanicida. Nos testes com fibronectina plasmática (FNp) e tecidual (FNt) em solução ou adsorvidas à placa na ativação dos Nθs, observamos que apenas a FNt adsorvida foi capaz de induzir NETs, que são reduzidas quando Nθs são pré-tratados com a sequência de aminoácidos arginina-glicina-aspartato (RGD). Colágeno tipo I e IV não induziram a liberação de NETs. Nossos dados revelaram que a LM e FNt podem contribuir para o mecanismo de liberação das NETs pelos Nθs, cujo impacto no curso da inflamação ou infecção necessita de mais estudos.

Palavras-chave: Laminina; redes extracelulares de neutrófilos (NETs); Leishmania amazonensis

Different stimuli recruit neutrophils (Nθ) from the bloodstream, which migrate through the endothelium reaching the tissue, where they play microbicidal mechanisms such as phagocytosis, degranulation and the release of extracellular neutrophil traps (NETs). These steps occur in close contact with proteins of the basement membrane (BM), extracellular matrix (MEC), where laminins, fibronectin and collagen are abundant. Here, we investigate the interactions between Nθs and different isoforms of laminin (LM), fibronectin and collagen by analyzing the release of NETs. Our results showed that Nθs stimulated with LM-111, 211, 332, 411, 421 and 511, released NETs. The same happened when Nθs interacted with LM 111, 411 and 511 polymerized. NETs released by LM were partially inhibited by pretreating Nθs with the anti-integrin α6 antibody, a reduction of 37%, 32% and 35% when stimulated with LM-111, -411 and -511, respectively. The release of NETs by LM-511 was dependent on reactive oxygen species (ROS), while the release induced by LM-411 was independent of ROS. In addition, the NETs released by the LMs were dependent on elastase and peptidylarginine deiminase (PAD)- 4, enzymes that participate in the chromatin decondensation process. We show that LM-111, 411 and -511 have a synergistic effect on NETs induced by Leishmania amazonensis promastigotes. NETs induced by LM-511 play a leishmanicidal role. Testing plasma (pFN) and tissue (tFN) fibronectin, in solution or adsorbed to the plate in the activation of Nθs, we demonstrated that only the adsorbed tFN was able to induce NETs, which are reduced when Nθs are pretreated with the amino acid sequence arginine-glycine-aspartate (RGD). Type I and IV collagen did not induce NET release. Our data revealed that LM and FNt can contribute to the mechanism of NETs release by Nθs, whose impact on the course of inflammation or infection needs further stdies. Keywords: laminin; neutrophil extracellular traps (NET); Leishmania amazonensis.

Keywords: Laminin; neutrophil extracellular traps (NET); Leishmania amazonensis

Título: Estudo do papel protetor dos linfócitos T CD4+ e da inflamação cerebral em camundongos infectados com o vírus da Zika
Aluno: Jamil Zola Kitoko
Orientador(es): Profa. Priscilla Christina Olsen, Prof. Marcelo T. Bozza

O vírus da Zika (ZIKV) é um vírus da família Flaviviridae, originalmente isolado em 1947 em Uganda, que se divergiu em duas linhagens, a africana e a asiática, estando a última relacionada com a epidemia de doença febril nas Américas em 2015. A infecção por ZIKV em adultos geralmente é assintomática, porém em casos raros ela pode levar à inflamação do sistema nervoso central ou à síndrome de Guillain-Barré. Nestes casos graves, o perfil da inflamação e da infecção cerebral após a infecção por ZIKV é desconhecido. Além disso, a resposta imune adaptativa protetora contra o ZIKV tem sido atribuída aos linfócitos T CD8+ e aos anticorpos neutralizantes, enquanto que o papel dos linfócitos T CD4+ ainda não foi esclarecido. Neste trabalho, estudamos o papel dos linfócitos T CD4+ na infecção por ZIKV, assim como a dinâmica da infecção e inflamação cerebral. Camundongos de 4 semanas de idade deficientes no receptor do interferon do tipo I Ifnar1-/-) foram infectados com as linhagens asiática PE243) ou africana (MR766) de ZIKV (2 × 105 PFU, i.v.) e a resposta imune adaptativa no baço, além da inflamação e infecção cerebral, foram avaliadas. A infecção do camundongo Ifnar1-/- com PE243 levou a ativação de linfócitos T e B protetores, além de baixa inflamação e baixa presença de partículas virais infectivas no cérebro. Por outro lado, a infecção com MR766 foi letal e associada com uma baixa ativação de linfócitos T e com a elevada presença do vírus e de infiltrado de linfócitos T CD8+ e monócitos no cérebro. A transferência adotiva de linfócitos T CD4+ oriundos do animal infectado com PE243 limitou a presença do vírus no cérebro dos camundongos Ifnar1-/- infectados com MR766, protegendo-o da infecção letal de modo dependente de IFNγ. Os linfócitos T CD4+ e o IFNγ se mostraram importantes para a indução da produção de anticorpos IgG neutralizantes anti-ZIKV. Apesar dos macrófagos CD206hi cerebrais serem as principais células infectadas por ZIKV antes da inflamação maciça no cérebro, a depleção dessas células não alterou a presença de leucócitos no cérebro do animal infectado com MR766. Conclui-se que os linfócitos T CD4+ e o IFNγ são cruciais na proteção contra o ZIKV mediada por anticorpos neutralizantes, prevenindo a presença do vírus no cérebro e a letalidade da infecção.

Palavras-chave: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação

The Zika virus (ZIKV) is a member of Flaviviridae family firstly isolated in 1947 in Uganda, which diverged in two strains, the African and Asian, and the last one is related with the epidemic of an exanthematic disease in the Americas in 2015. In adults, ZIKV infection is usually asymptomatic, but in rare cases it leads to the inflammation of the central nervous system or Guillain-Barré syndrome. In these severe cases, the pattern of brain inflammation and infection is not known. In addition, the protective adaptive immune response against ZIKV has been attributed to CD8+ T lymphocytes and neutralizing antibodies, while the role of CD4+ T lymphocytes has not yet been clarified. We aimed to study here the role of CD4+ T lymphocytes as well as the dynamics of brain infection and inflammation during ZIKV infection. Four-week-old mice deficient in type I interferon receptor (Ifnar1-/-) were infected with ZIKV Asian (PE243) or African (MR766) lineages (2 × 105 PFU, i.v.) and evaluated for the adaptive immune response in the spleen and the inflammation and infection of the brain. Infection of the Ifnar1-/- mouse with PE243 led to the activation of protective T CD4+ , T CD8+ and B lymphocytes, in addition to low inflammation and presence of infective viral particles in the brain. On the other side, infection with MR766 as lethal and associated with low activation of T lymphocytes and the high presence of the virus and CD8+ T lymphocytes and monocytes infiltrate in the brain. The adoptive transfer of CD4+ T lymphocytes from PE243-infected mice was able to limit the presence of the virus in the brain of Ifnar1-/- mice infected with MR766, thus protecting from lethal infection. CD4+ T lymphocytes and IFNγ were shown to be critical by inducing ZIKV neutralizing antibodies IgG anti-ZIKV. Although brain CD206hi macrophages are the main cells infected with ZIKV before massive brain inflammation, depletion of these cells did not alter the presence of leukocytes in the brain of the animal infected with MR766. We concluded here that CD4+ T lymphocytes and IFNγ are crucial in the protection against ZIKV mediated by neutralizing antibodies, preventing against viral presence in the brain and lethal infection.

Keywords: ZIKV;CD4+ T lymphocytes;antibodies;interferon γ;inflammation

Título: Mecanismos envolvidos na indução da netose em resposta ao fungo Aspergillus Fumigatus e o papel das nets na aspergilose experimental
Aluno: Juliana da Costa Silva
Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) é um fungo saprofítico ambiental capaz de causar doenças a humanos. Os neutrófilos são células efetoras durante quadros de infecções fúngicas, sendo a neutropenia um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento da aspergilose pulmonar invasiva. Neutrófilos são capazes de liberar NETs (Neutrophil Extracellular Traps) em resposta ao A. fumigatus inibindo assim, a germinação do conídio desse fungo. Neste trabalho foi observado que os receptores TLR2, TLR4 e Dectin-1 não estão envolvidos na liberação de NETs em resposta ao A. fumigatus. No entanto, a participação de CD11b/CD18 é crucial para a liberação de NETs em resposta aos conídios desse fungo, e isso depende do reconhecimento mediado pelo domínio I de CD11b, enquanto o bloqueio do domínio de lectina dessa molécula não afetou a liberação de NETs. A liberação de NETs frente ao A. fumigatus envolve atividade das proteínas Syk, Src cinase(s), PI3K classe IA δ e AKT. No entanto, essa liberação de NETs induzida pelo A. fumigatus não envolve a atividade de PKCs. A liberação de NETs em resposta ao A. fumigatus requer a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela ativação do complexo NOX2, e esta geração de ROS ocorre de forma dependente de CD11b/CD18 (Mac-1), da ativação de Src cinase, Syk e PI3K classe IA δ e AKT. Embora o desafio com A. fumigatus promova citrulinação de histonas, este processo é dispensável para a liberação de NETs em resposta aos conídios desse fungo. Em um modelo experimental de aspergilose pulmonar, camundongos infectados com A. fumigatus apresentam estruturas de redes de DNA em proximidade a conídios, além disso, a administração de DNAseI resulta em aumentada mortalidade no modelo de aspergilose experimental pulmonar. Nossos resultados deste modo demonstram a via de sinalização envolvida na liberação das NETs em resposta ao A. fumigatus e um possível papel dessas NETs em um modelo experimental de aspergilose pulmonar.

Palavras-chave: Aspergillus fumigatus; CD11b/CD18/Mac-1; Neutrophil extracellular traps; Neutrófilos; PAD4

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is an environmental fungus and a human pathogen. Neutrophils are critical effector cells during fungal infections, and neutropenia is a risk factor for the development of pulmonary aspergillosis. NETs are released by neutrophils in response to A. fumigatus and inhibit the conidial germination. In this work we observed that the receptors TLR2, TLR4 and Dectin-1 were dispensable for the A. fumigatus-induced NET release. In contrast, CD11b/CD18 was critical for NET release in response to A. fumigatus conidia, and this required the CD11b I-domain mediated recognition, while the blockade of the CD11b lectin domain did not affect the A. fumigatus induced NET release. A. fumigatus-induced NET release relied on the activity of Syk, Src family kinase(s), and class IA PI3 kinase δ and AKT. In contrast, conventional PKCs were dispensable for the NET release in response to A. fumigatus. The A. fumigatus induced NET release required reactive oxygen species generation by NOX2 complex, in a downstream pathway requiring CD11b/CD18, Src kinase family activity, Syk and PI3K class IA δ and AKT. Although A. fumigatus promoted histone citrullination, this process was dispensable for the NET release in response to A. fumigatus conidia. In experimental model of aspergillosis, mice infected with A. fumigatus showed NETs associated with conidia, furthermore, the administration of DNAseI increased mortality in murine modelo of pulmonary aspergilosis. Our results demonstrate the signaling pathway involved in NETs release induced by A. fumigatus and a possible role of NETs in experimental model of pulmonary aspergillosis.

Keywords: Aspergillus fumigatus; CD11b/CD18/Mac-1; PAD4; Neutrophil extracellular traps; Neutrophil

Título: Dinâmica de subpopulações de linfócitos B na leishmaniose visceral e identificação de epítopo linear conservado como alvo terapêutico de anticorpos protetores
Aluno: Luciana Conde Rodrigues Maia
Orientador(es): Prof. Alexandre Morrot Lima, Prof. Célio Geraldo Freire de Lima

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania transmitido por vetores flebotomíneos. Classicamente, a LV causa hepatoesplenomegalia, sendo o fígado e o baço os principais órgãos acometidos durante a doença. A LV é associada com imunossupressão sistêmica, levando a inabilidade do hospedeiro vertebrado de combater a disseminação do parasita. Na literatura, é demonstrado que a resposta imune humoral atua favorecendo o parasitismo e exacerbação da doença. As células B possuem diferentes subpopulações que diferem em seu aspecto fenotípico e funcional. Neste trabalho, avaliamos a dinâmica das subpopulações de células B no curso da LV experimental por L. infantum chagasi, a fim de expandir o conhecimento da resposta humoral às leishmanioses. Demonstramos que há diminuição de células de zona marginal (MZ) no baço de animais infectados durante o curso da infecção, essas células perdem seu potencial responsivo em períodos tardios secretando menos anticorpos frente a estímulos policlonais. No timo, demonstramos que há um aumento de células B no curso da infecção, evidenciado pelo aumento de células B CD23+ e diminuição tardia de células B CD5+ . Em conjunto, esses dados demonstram mudanças pontuais no compartimento de células B no curso da LV experimental. Em adição a esses estudos, também investigamos a presença de epítopos lineares de célula B a partir de análise de microarray de peptídeos cobrindo todas as sequências possíveis de proteínas de superfície de formas infectivas do parasita. Detectamos um epítopo imunodominante no soro de camundongos C57BL/6 infectados, o qual representa a sequência linear conservada evolutivamente ANTSNMP presente em um sítio catalítico da ATPase Vacuolar (V-ATPase). Nosso ensaios in vitro demonstraram que anticorpos monoclonais inibem a atividade da enzima causando diminuição na porcentagem de macrófagos infectados e menos replicação intracelular do parasita. Análise da imunidade humoral de camundongos infectados demonstrou aumento de anticorpos IgM e diminuição de IgG anti-ANTSNMP, sugerindo uma possível restrição a mudança de classe para formas efetoras de anticorpos contra este epítopo. Este trabalho demonstra evidências que levam ao questionamento sobre o mimetismo molecular entre epítopos lineares de célula B compartilhados entre o parasita e o hospedeiro vertebrado induzindo tolerância imunológica ao parasita, restringindo a diferenciação de respostas humorais efetoras e contribuindo para a persistência do parasita associada a imunossupressão característica da LV.

Palavras-chave: Células B; leishmaniose visceral; epítopos lineares.

Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected disease caused by protozoa of the genus Leishmania transmitted by sandfly vectors. Classically, VL causes hepatosplenomegaly, with the liver and spleen being the main organs affected during the disease. VL is associated with systemic immunosuppression, leading to the vertebrate host's inability to contain parasite spread. It has beendemonstrated that the humoral immune response acts favoring parasitism and disease exacerbation. B cells have different subpopulations that differ in their phenotypic and functional aspect. In this work, we evaluate the dynamics of B cell subpopulations in the course of experimental VL by L. infantum chagasi in order to expand the knowledge of the humoral response to leishmaniasis. We demonstrate a decrease in marginal zone (MZ) cells in the spleen of infected animals during the course of infection, these cells lose their responsive potential in later periods by secreting fewer antibodies against polyclonal stimuli. In thymus, we demonstrated that there is an increase of B cells in the course of infection, evidenced by the increase of CD23+ B cells and late decrease of CD5+ B cells. Taken together, these data demonstrate point changes in the B cell compartment in the course of experimental VL. In addition to these studies, we also investigated the presence of linear B-cell epitopes from peptide microarray analysis covering all possible surface protein sequences of infectious forms of the parasite. We detected an immunodominant epitope in the serum of infected C57BL/6 micethat represents the evolutionarily conserved linear sequence ANTSNMP present at a Vacuolar ATPase (V-ATPase) catalytic site. Our in vitrodemonstrated that monoclonal antibodies inhibit enzyme activity causing a decrease in the percentage of infected macrophages and less intracellular replication of the parasite. Analysis of humoral immunity of infected mice demonstrated increased IgM antibodies and decreased anti-ANTSNMP IgG, suggesting a possible restriction of class switching to effector forms of antibodies against this epitope. This work demonstrates evidence leading to the question of molecular mimicry between linear B-cell epitopes shared between parasite and vertebrate host inducing parasite immunological tolerance, restricting the differentiation of effector humoral responses and contributing to parasite persistence associated with characteristic immunosuppression. from LV.

Keywords: B cells; visceral leishmaniasis; linear epitopes

Título: Papel dos mastócitos na neovascularização inflamatória em modelo de infecção da bolsa jugal do hamster pelo Trypanosoma cruzi
Aluno: Lucas Vellasco de Mattos
Orientador(es): Prof. Julio Scharfstein

O extravasamento de plasma induzido por fatores pró-angiogênicos possibilita a formação de uma matriz provisória de fibrina que dá suporta a migração de células endoteliais ativadas durante o processo de neovascularização. Células da imunidade inata como macrófagos e mastócitos liberam fatores pró-angiogênicos, como IL-8, IL-1β, IL-6 and VEGF em resposta a diversos estímulos. Recentemente, nosso grupo demonstrou que o extravasamento de plasma, propagado por mastócitos através de um eixo que envolve a ativação da via de contato e liberação de bradicinina, estimula o parasitismo, a miocardite e a deposição de colágeno. Neste trabalho, foi investigado o impacto do parasitismo na bolsa jugal do hamster (BJH) após a inoculação de tripomastigotas da cepa Dm28c expressando a proteína GFP (TCT-GFP). Um método computacional foi desenvolvido para quantificar parâmetros angiogênicos (área vascular – AV, comprimento vascular total - CVT e número de segmentos de vasos – NS) e inflamatórios (unidades relativas de fluorescência – URF e fluorescência não vascular – FNV). As imagens de microscopia intravital mostraram angiogênese na BJH em 7 dias após a inoculação de 106 TCT-GFP. A neovascularização foi associada a infiltrado inflamatório e aumento da densidade de macrófagos CD68+ e mastócitos, além da produção de IL-1β. A relação entre o parasitismo e a angiogênese foi embasada por: i) ausência de inflamação e angiogênese em resposta a injeção de epimastigotas (forma parasitária não infectiva) da cepa Dm28c e ii) inibição da neovascularização inflamatória após o tratamento com benznidazol (um antiparasitário), iniciado 24 horas pós-infecção. O tratamento com benznidazol inibiu também a produção de IL-1β em resposta a infecção. Com o objetivo de saber a distribuição dos parasitas após a inoculação na BJH, inoculamos 106 TCT-GFP em conjunto com 106 TCT expressando a enzima luciferase. A injeção intravenosa com Dluciferina mostrou a distribuição dos parasitas na BJH em 7, 14 e 21 dpi, assim como nas glândulas salivares e na gordura anexa ao tecido. Análises moleculares mostraram a presença de parasitas no coração dos hamster em 7, 14, 21 e 30 dpi. A BJH foi examinada em 3 dpi, quando a neovascularização é ainda incipiente, com o objetivo de descobrir o perfil 9 inflamatório e os fatores pró-angiogênicos produzidos em resposta a infecção. O aumento nas URF e FNV indica que, em 3 dpi, a barreira endotelial encontra-se desestabilizada o que resulta em aumento da permeabilidade vascular. Análises por PCR quantitativo mostraram correlação positiva entre a expressão gênicas de citocinas (pró-IL-1β e IFN-γ) e parâmetros angiogênicos (NS e CVT) em 3 dpi. A produção de IL-1β, confirmada por ELISA, foi inibida pelo tratamento com benznidazol (100 mg/kg/dia, oral). Análises proteômicas em 3 dpi mostraram aumento na expressão da quimase, uma protease de mastócitos, também inibido pelo tratamento com benznidazol. A quimase é uma protease liberada por mastócitos em eventos de degranulação, a qual teve efeitos pró-angiogênicos mostrados em modelo utilizando o hamster sírio. Além de degradar a matriz extracelular, liberando fatores angiogênicos, a quimase converte angiotensina I em angiotensina II, peptídeo que induz a produção de VEGF por fibroblastos. Os hamster foram tratados com inibidores da quimase (quimostatina e TY-51469) e da enzima conversora de angiotensina (captopril). Esses inibidores de proteases reduziram significativamente os parãmetos de angiogênese e inflamação, aumentados em resposta a infecção. Apesar da redução de FNV e CVT, o tratamento dos hamster com cromoglicato (um inibidor da degranulação de mastócitos) não inibiu a angiogênese de forma semelhante aos outros tratamentos. Em conjuntos, em dados sugerem a importância da quimase, uma protease de mastócitos, na neovascularização inflamatória em resposta a infecção por T. cruzi.

Palavras-chave: angiogênese; inflamação; mastócitos; Trypanosoma cruzi; quimase.

Microvascular leakage induced by proangiogenic factors fosters the formation of a provisional fibrin matrix that supports the migration of endothelial-tip cells at the onset of neovascularization. Innate immunitry cells, such as macrophages and mast cells, realease proangiogenic factors, such as IL-8, IL-1β, IL-6 and VEGF, in response to diverse stimuli. We reported that plasma leakage, a mast cell (MC)--driven inflammatory response propagated via cycles of bradykinin release and contact system activation, fuels heart parasitism, myocarditis and collagen deposition. Here we investigated the impact of tissue parasitism in the microcirculation of the hamster cheek pouch (HCP) following challenge by Dm28c tissue culture trypomastigotes (TCT) expressiong GFP protein. A previously deleveloped computer based method allowed the analysis of intravital microscopy images and quantiftation of different angiogenesis (number of segments – NS, total vascular length – TVL and vascular area – VA) and inflammation parameters (non vascular fluorescence - NVF and relative fluorescence units – RFU). Intravital microscopy (IVM) showed angiogenesis in HCP at 7 dpi in comparison to PBS injected controls and contralateral tissues.. Neovascularization was associated to inflammatory infiltrate, increased density of MCs, increased number and percentage of CD68+ macrophages and also IL-1β production. The link between parasitism and angiogenesis was supported by evidences that (i) injection of the same dose of Dm28c epimastigotes did not induce changes of angiogenesis indices in the HCP (ii) Benznidazole (BZN) treatment initiated 24 h after TCT inoculation abrogated inflammatory neovascularization at 7 dpi. Benznidazole treatment also inhibited IL-1β production. In attempt to know the distribution of parasities within different organs, hamsters were inoculated with TCT-GFP and TCT Dm28c expressing luciferase. Hamsters were systemically injected (i.v) with D-luciferin and bioluminescence revealed the distribution of TCT-GFPs in the infected HCPs and parasitism in salivary glands and also hamster cheek pouch fat on 7, 14 and 21 dpi. Molecular analysis demonstrated parasite load in the heart on 7, 14 and 21 dpi. We examined the HCP on 3 dpi, when neovascularization is still incipient, in 11 order to know the inflammatory profile and proangiogenic factors produced in response to infection. Relative fluorescence units and non-vascular fluorescence (dextran-FITC) were slightly increased, suggesting that endothelial barrier function is altered on 3 dpi. Quantitative PCR analysis revealed a positive correlation between pro-IL-1β and IFN-γ expression and angiogenesis parameters (NS and TVL) on 3 dpi. IL-1β production was confimed by ELISA and benznidazole treatment reduced the concentration of this cytokine in HCP homogenates at this time point. Next, we conducted proteomic analysis in infected HCP (3 dpi) versus infected/BZN-treated hamsters and found upregulated levels of chymase, a MC protease, previously appointed as a driver of angiotensin II-dependent angiogenesis in the hamster sponge model. T.cruzi-induced angiogenesis was blocked by an angiotensin II converting enzyme inhibitor (captopril – 10 mg/kg/day, ip), chymostatin (2 mg/kg/day, ip) and TY51469 (10 mg/kg/day, ip), a selective chymase inhibitor. Although cromoglicate (40 mg/kg/day, ip) treatment demonstrated an anti-inflamatory effect, reducing NVF and RFU, this drug was less effective in inhibbting neovascularization. These data suggest the importance of mast cell chymase for inflammatory neovascularization in the TCT-GFP infected HCP.

Keywords: mast cell; inflammation; angiogenesis; Trypanosoma cruzi; chymase

Título: Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório da mangiferina no modelo murino.
Aluno(a): Jorgete Logullo de Oliveira
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima

Durante várias décadas, os produtos naturais desempenharam um papel promissor no tratamento e prevenção de doenças humanas. Uma xantona natural (2-D-glucopiranosil-1,3,6,7-tetra-hidroxi-9Hxanten- 9-ona) chamada mangiferina está presente em mangueiras e outras plantas, têm sido descritas como um importante componente imunomodulador que apresenta grande potencial farmacológico. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea e formam uma das primeiras linhas de defesa do sistema imunológico contra infecções. Foi descoberto recentemente um conceito inovador sobre neutrófilos; um novo mecanismo de morte celular, onde o DNA descondensado associado às histonas e as proteínas presentes nos grânulos e no citoplasma dos neutrófilos é liberado para o meio externo, sendo denominados de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Nós investigamos os efeitos imunomoduladores da mangiferina em neutrófilos murinos. O tratamento com mangiferina inibiu a migração de neutrófilos induzida pela caseína para a cavidade peritoneal para a corrente sanguínea. Porém, não inibiu a mobilização de neutrófilos da medula óssea. Avaliando o efeito da mangiferina na adesão e migração de neutrófilos in vitro demonstrou que esta xantona diminuiu a adesão dos neutrófilos em células CHO transfectadas com P- e Eselectina. Além disso, a mangiferina foi capaz de inibir a produção de NETs e ROS por neutrófilos murinos. Além do papel da mangiferina na migração de neutrófilos, investigamos os seus efeitos na dor usando modelos murinos, para avaliar sua capacidade analgésica e anti-inflamatória. Nossos dados fortemente sugerem que a mangiferina possui efeito antinociceptivo significativo contra a dor quimiogênica nos modelos experimentais de dor visceral induzida por ácido acético e na dor neuroinflamatória induzida por formalina e capsaicina. Os dados demonstrados sugerem que a mangiferina apresenta importantes ações imunomoduladoras nos processos inflamatórios agudos. 

Palavras-chave: Mangiferina; hiperalgesia inflamatória; citocinas pró-inflamatórias; neutrófilos;

For several decades, natural products have played a promising role in the treatment and prevention of human diseases. A natural xanthone (2-β-D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxy-9H-xanthen-9-one) called mangiferin is present in hoses and other plants have been described as an important immunomodulatory component that presents great pharmacological potential. Neutrophils are the most abundant leukocytes in the bloodstream and form one of the immune system's first lines of defense against infections. A novel concept on neutrophils has recently been discovered; a new mechanism of cell death, where the DNA associated with the histones and proteins present in the granules and cytoplasm of the neutrophils is released into the external environment and called neutrophil extracellular traps (NETs). We investigated the immunomodulatory effects of mangiferin on murine neutrophils. Treatment with mangiferin inhibited the migration of neutrophils to peritoneal cavity induced by casein. However, the mangiferina did not inhibit the mobilization of neutrophils from the bone marrow to the blood. Evaluating the effect of mangiferin on neutrophil adhesion and migration in vitro has shown that this xanthone decreased neutrophil adhesion in CHO cells transfected with P- and E-selectin. In addition, mangiferin was able to inhibit the production of NETs and ROS by murine neutrophils.. In addition to the role of mangiferin in neutrophil migration, we investigated its pain effects using murine models to assess its analgesic and antiinflammatory capacity. Our data strongly suggest that mangiferin has a significant antinociceptive effect against chemogenic pain in the experimental models of visceral pain induced by acetic acid and in neuroinflammatory pain induced by formalin and capsaicin. The data demonstrated suggest that mangiferin presents important immunomodulatory actions in acute inflammatory processes. 

Key words: Mangiferin; inflammatory hyperalgesia; proinflammatory cytokines; neutrophils;

Título: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DA MANGIFERINA NO MODELO MURINO.

Aluno(a): JORGETE LOGULLO DE OLIVEIRA

Orientador(es): Prof(a). CELIO GERALDO FREIRE DE LIMA

Título: Propriedades imunomoduladoras e mecanismos de reconhecimento e ativação celular da lisofosfatidilcolina (LPC) de Schistosoma mansoni em macrófagos.
Aluno(a): Leonardo Santos de Assuncao
Orientador(es): Prof^a Patricia Torres Bozza Viola

A esquistossomose mansônica, endemia parasitária típica das Américas, Ásia e África, é causada pela infecção de trematódeos da espécie Schistosoma mansoni. A infecção por este trematódeo induz no hospedeiro a formação de granulomas e uma potente polarização da resposta imune para o tipo Th2. A infecção prolongada também pode levar as células do sistema imune inato à um perfil regulador da inflamação. Os helmintos podem ser apresentados em diferentes estágios do seu ciclo de vida dentro de um hospedeiro humano, e cada estágio do desenvolvimento pode apresentar diferentes combinações de moléculas de superfície reconhecidas de diferentes formas pelo hospedeiro. Estudos recentes do nosso grupo demonstraram que lipídeos de S. mansoni, incluindo a lisofosfatidilcolina, possuem papel importante na indução da produção de mediadores inflamatórios em macrófagos. No presente trabalho investigamos o papel dos lipídeos de Schistosoma mansoni, em especial a LPC, na regulação do perfil de ativação de macrófagos e os possíveis mecanismos envolvidos neste processo. Demonstramos que a lisofosfatidilcolina (LPC) esquistossomal é capaz de polarizar os macrófagos para um perfil do tipo M2. Observamos que dentre as demais frações lipídicas esquistossomais, a LPC foi a única capaz de induzir a expressão de marcadores do tipo M2, como Arginase-1, e que isso ocorre de maneira dependente da ativação de PPARγ. A LPC não induz aumento na produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos, e em altas concentrações foi capaz de inibir a indução de NO gerada por LPS. Além disso, observamos que a LPC esquistossomal induz migração celular e polarização de macrófagos in vivo e estimula a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoneais in vitro. Observamos também que a LPC induz a biogênese de corpúsculos lipídicos de maneira dependente de PPARγ e TLR2. Em conjunto, esses resultados demonstram um papel importante da LPC esquistossomal em ativar macrófagos para um perfil do tipo M2, com formação de corpúsculos lipídicos, através de mecanismos dependentes de PPARγ.

Palavras-chave: Schistosoma; Macrófago; Lipídeo, M2;PPAR; Lisofosfatidilcolina

Schistosomiasis mansoni, parasitic endemic typical of the Americas, Asia and Africa, is caused by the infection of Schistosoma mansoni trematodes. Infection by this trematode induces the formation of granulomas in the host and a potent polarization of the immune response to the Th2 type. Prolonged infection can also lead to the modulation of cells of the innate immune system to a profile that regulates inflammation. Helminths may be presented at different stages of their life cycle within a human host, and each stage of development may present different combinations of glycoconjugates recognized in different ways by the host. Recent studies in our group have demonstrated that S. mansoni lipids, including lysophosphatidylcholine, play an important role in inducing the production of inflammatory mediators in macrophages. In the present work we investigated the role of Schistosoma mansoni lipids, especially LPC, in the activation profile of macrophages and the possible mechanisms involved in this process. We have demonstrated that schistosomic lysophosphatidylcholine (LPC) is able to polarize macrophages to an M2-like profile. We observed that among the other schistosomic lipid fractions, LPC was the only one capable of inducing the expression of M2-like markers, such as Arginase-1, and that this occurs in a manner dependent on the activation of PPARγ. LPC did not induce an increase in the production of nitric oxide (NO) in macrophages, and in high concentrations it was able to inhibit the induction of NO generated by LPS. In addition, we observed that schistosomic LPC induces cell migration and macrophage polarization in vivo and stimulates the formation of lipid corpuscles in peritoneal macrophages in vitro. We also observed that LPC induces lipid body biogenesis in a manner dependent on PPARγ and TLR2. Taken together, these results demonstrate an important role of schistosomic LPC in activating macrophages to an M2-like profile, with formation of lipid bodies, through PPARγ-dependent mechanisms.

Keywords: Schistosomiasis; Macrophages; M2; PPAR; Lipds; Lysophosphatidylcholine

Título: Própolis e ácido cafeico promovem reparo tecidual pulmonar após enfisema induzido por fumaça de cigarro
Aluno(a): Marina Valente Barroso
Orientador(es): Prof. Samuel dos Santos Valenca

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma doença progressiva e incurável. Sua principal causa é a inalação de fumaça de cigarro (do inglês, cigarette smoke - CS). Produtos naturais têm mostrado propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes que podem prevenir a inflamação pulmonar aguda e também o enfisema, mas existem ainda poucos estudos na literatura com relação ao tratamento do enfisema já estabelecido. A hipótese deste estudo é que o própolis e o seu principal ativo (ácido cafeico) podem potencialmente reparar o dano pulmonar no enfisema causado pela fumaça de cigarro. Para isso, camundongos foram expostos à fumaça de cigarro por 60 dias, e nos 60 dias subsequentes foram tratados ou por via oral com própolis ou via inalatória com o ácido cafeico nebulizado em diferentes doses (0,2 mg, 1 mg e 5 mg). Análises histológicas mostraram significativa melhora na histoarquitetura pulmonar, com recuperação de septos alveolares e componentes da matriz como fibras elásticas e colágenas nos grupos tratados com própolis e com a maior dose de ácido cafeico (5 mg). O tratamento com própolis aumentou a expressão da metaloprotease MMP-2 e diminuiu a expressão da MMP-12, favorecendo o processo de reparo tecidual. Além disso, o tratamento com própolis recrutou leucócitos, principalmente macrófagos, mas sem a liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando à ativação alternativa desses macrófagos, que se tornaram positivos para arginase, além de aumentar os níveis de IL-10, favorecendo um micro-ambiente anti-inflamatório. O tratamento com ácido cafeico também mostrou ação anti-inflamatória quando diminuiu o dano oxidativo medido pelos níveis de MDA, e também diminuiu os níveis de IL-8. Investigando a participação da via do Nrf2 no reparo tecidual, foi observado que o própolis não ativou essa via, na verdade diminuindo a translocação desse fator para o núcleo, e consequentemente a expressão de enzimas relacionadas, exceto NQO1, que parece ser ativada por via alternativa. Própolis também regulou negativamente a expressão do fator de crescimento IGF1, assim como o tratamento com ácido cafeico regulou negativamente a expressão de β-catenina e Wnt3, todos participantes de processos de reparo tecidual. Assim sendo, o própolis promoveu reparo tecidual no modelo de enfisema murino aumentando o percentual de macrófagos M2 em paralelo com a regulação negativa da expressão de IGF1 de uma maneira independente de Nrf2. O ácido cafeico também promoveu recuperação do parênquima pulmonar e componentes de matriz com ação anti-inflamatória e regulando negativamente a via de Wnt/β-catenina.

Palavras-chave: enfisema; própolis; ácido cafeico; reparo tecidual; pulmão; Nrf2.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is an incurable and progressive disease. The main cause of this condition is cigarette smoke (CS). Natural products have shown anti-inflammatory and antioxidant properties that can prevent acute lung injury and emphysema, but there are few reports in the literature regarding treatments to already established-emphysema. The hypothesis of this study is that propolis and its main active (caffeic acid), could potentially repair lung damage in emphysema caused by CS exposure. Mice were exposed to 60 days of CS, and after that, they were treated orally with propolis or nebulized with caffeic acid in different doses (0,2 mg, 1 mg and 5 mg) for additional 60 days. Histological analysis revealed significant improvements in lung histoarchitecture, with recovey of alveolar septa and matrix components such as elastic and collagen fibers in groups treated with propolis and with the highest dose of caffeic acid (5 mg). Propolis treatment increased MMP-2 expression and decreased MMP-12 expression, favoring the process of tissue repair. Additionally, propolis recruited leukocytes, mainly macrophages, but without ROS release, leading to macrophage alternative activation, which became arginase-positive cells, besides increasing IL-10 levels, favoring an anti-inflamatory microenvironment. Treatment with caffeic acid also showed an anti-inflammatory action, decreasing oxidative damage measured by MDA levels, and IL-8 levels. The participation of Nrf2 pathway in tissue repair was investigated, and treatment with propolis did not activate this pathway, actually decreasing Nrf2 translocation to the nucleus, and consequently, the expression of all enzymes related to Nrf2 pathway, except for NQO1, which seemed to be activated by an alternative pathway. Propolis also downregulated IGF1 expression, as well as caffeic acid treatment donwregulated β-catenin and Wnt3 expression, all participants of tissue repair processes. Therefore, propolis treatment promoted lung repair in a mouse emphysema model increasing the percentage of M2 macrophages in parallel to the downregulation of IGF1 expression in a Nrf2-independent manner. Caffeic acid treatment also promoted parenchyma matrix components recovery, with anti-inflammatory action and downregulating Wnt/β-catenin pathway.

Key words: emphysema; propolis; caffeic acid; tissue repair; lung; Nrf2

Título: Ativação do inflamassomo canônico nlrp3/caspase-1 em resposta ao fungO Aspergillus fumigatus RIO.
Aluno(a): Morena Scopel de Amorim Mendonca
Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo

Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso oportunista, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes imunossuprimidos, acometidos com a aspergilose invasiva. O reconhecimento do fungo e a liberação de citocinas como a IL-1β e o TNF-α ocorrem através de receptores da imunidade inata, dentre eles a Dectina-1 e o complexo inflamassomo NLRP3. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamassomo NLRP3 durante a infecção pelo A. fumigatus. Macrófagos alveolares murinos, macrófagos peritoneais elicitados murinos, células CD11c+MHCII+ e células dendríticas humanas foram estimuladas com conídios de A. fumigatus e a liberação de IL-1β avaliada por ELISA. Observamos que as diferentes células mielóides liberaram IL-1β em resposta ao A. fumigatus, mediante a ativação de Dectina-1 e syk, bem como, NLRP3, ASC e caspase-1. O efluxo de potássio e a caspase-8 também foram necessários para a liberação de IL-1β por macrófagos murinos estimulados com conídios de A. fumigatus. Estas células ainda sofreram morte celular dependentemente de Dectina-1 e caspase-1. Experimentos in vivo demonstraram que NLP3 regula a liberação de IL-1β no sitio da infecção, e animais imunocomprometidos deficientes em caspase-1 sobrevivem mais a infecção do que animais selvagens. Os resultados em conjunto indicam que a liberação de IL-1β em resposta ao A. fumigatus requer a via de sinalização Dectina-1/syk e ativação do inflamassomo NLRP3/ASC/Caspase-1 através do efluxo de potássio e ativação de caspase-8, e caspase-1 parece ter um papel deletério durante o curso da infecção com o fungo.

Palavras-chave: Aspergillus fumigatus; Inflamassomo; IL-1β

Aspergillus fumigatus is an opportunistic filamentous fungus, being an important cause of morbidity and mortality in immunosuppressed patients, afflected by invasive aspergillosis. Fungus recognition and release of cytokines such as IL-1β and TNF-α occur through innate immunity receptors, including Dectin-1 and the inflammasome NLRP3. This work aimed to investigate the molecular mechanisms involved in the activation of NLRP3 inflammation during A. fumigatus infection. Murine alveolar macrophages, murine elicited peritoneal macrophages, CD11c+MHCII+ cells and human dendritic cells were stimulated with A. fumigatus conidia and IL-1β release detected by ELISA. We observed that the different myeloid cells released IL-1β in response to A. fumigatus, through the activation of Dectin-1 and Syk, as well as, NLRP3, ASC and Caspase-1. The potassium efluxand caspase-8 were also required for the release of IL-1β by murine macrophages stimulated with A. fumigatus conidia. Also, these cells suffered cellular death dependent on Dectin-1 and Caspase-1. In vivo experiments have demonstrated that NLP3 regulates the release of IL-1β at the site of infection, and caspase-1 deficient immunocompromised mice are more resistant to infection, presenting a higher survival than wild mice. The results together indicate that the release of IL-1β in response to A. fumigatus requires the Dectin- 1/Syk signaling pathway and activation of the NLRP3/ASC/ caspase-1 inflammasome via potassium efflux and activation of caspase-8, and caspase-1 appears to play a deleterious role during the course of infection with the fungus. 

Keywords: Aspergillus fumigatus; Inflammasome; IL-1β

Título: O papel da Heme Oxigenase-1 na imunopatogênese da Hanseníase
Aluno(a): Rhana Berto da Silva Prata
Orientador(es): Prof^a Roberta Olmo Pinheiro

A hanseníase é um doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae. Possui um espectro de formas clínicas, onde no pólo tuberculóide (Paucibacilar) a resposta imune é caracterizada pela maior resposta imune celular do tipo Th1, enquanto no pólo lepromatoso (Multibacilar) há o predomínio da resposta do tipo Th2. Os indivíduos acometidos podem desenvolver estados reacionais, podendo ocorrer antes, durante ou após o tratamento e são classificados como reação reversa (RR) e eritema nodoso hansênico (ENH). Por ter uma transmissão por via área e a relação longa e persistente leva ao grupo de contatos a desenvolver um maior risco de desenvolver a doença. Como já descrito, as moléculas de captação e armazenamento de ferro nos macrófagos são aumentadas em pacientes multibacilares. Nesse trabalho, demonstramos que a enzima HO-1 é aumentada durante a infecção e possui uma maior expressão em pacientes multibacilares, assim como o aumento de CD163s e IL-10. Demonstramos também que, em pacientes com ENH, há uma diminuição de CD163s e IDO e um aumento de HO-1 e LDH. Demonstramos ainda que a HO-1 possui uma expressão aumentada em contatos de grupo de risco, além disso, contatos que possuem os níveis de HO-1 aumentados no momento da triagem, desenvolvem a doença posteriormente. Finalmente, observamos que a HO-1 possui um papel preditivo na progressão da doença e no adoecimento dos contatos.

Palavras-chave: HO-1; Hanseníase; Macrófago; Biomarcador Contatos; Eritema Nodoso Hansênico

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It has a spectrum of clinical forms, wherein the tuberculoid pole (Paucibacillary) the immune response is characterized by the greater Th1 type cellular immune response, whereas in the lepromatous pole (Multibacillary) the Th2 type predominates. The individuals affected may develop reactional states, which may occur before, during or after treatment and are classified as the reverse reaction (RR) and the erythema nodosum leprosum (ENH). By having an area-based transmission and the long and persistent relationship leads the group of contacts to develop a greater risk of developing the disease. As already described, iron uptake and storage molecules in macrophages are increased in multibacillary patients. In this work, we demonstrated that the HO-1 enzyme is increased during infection and has a greater expression in multibacillary patients, as well as an increase in CD163s and IL-10. We also demonstrated that in patients with ENL there is a decrease in CD163s and IDO and an increase in HO-1 and LDH. We further demonstrate that HO-1 has an increased expression in risk group contacts, moreover, contacts that have increased levels of HO-1 at the time of screening further develop the disease. Finally, we observed that HO-1 has a predictive role in the progression of the disease and in the sickness of the contacts. Keywords: HO-1; Leprosy; Macrophage; Biomarker; household contacts; Erythema nodosum leprosum

Key words: HO-1;Leprosy;Macrophage;Biomarker;household contacts;Erythema nodosum leprosum

Título: Influência dos linfócitos T no compartimento hematopoiético da medula óssea no modelo de tumor de mama murino
Aluno(a): Triciana Goncalves da silva
Orientador(es): Prof^a Adriana Cesar Bonomo

Como em outras desordens inflamatórios sistêmicas, durante a progressão tumoral, há uma grande demanda por células de origem hematopoiética, cruciais para o desenvolvimento do tumor primário e metastático. Embora as células imunes adaptativas respondam à apresentação de antígenos com ativação e proliferação, as células imunes inatas precisam ser reabastecidas a partir da diferenciação e maturação de progenitores hematopoiéticos, em um processo chamado hematopoiese de emergência. Já demonstramos que as células T são essenciais para manter a hematopoiese "homeostática". No entanto, como células T contribuem para hematopoiese de emergência evocada pela progressão do tumor de mama murino não foi investigada. Para analisar esse fenômeno, camundongos BALB/c fêmeas foram inoculados ortotopicamente com tumor singeneico metastático 4T1 ou não-metastático 67NR e células da medula óssea (MO) e do sangue periférico (SP) foram avaliadas. Os tumores metastáticos e não-metastáticos induzem diferentes alterações na hematopoiese. Enquanto os camundongos-4T1 acumulam neutrófilos no SP, os animais-67NR acumulam monócitos/macrófagos. O perfil do SP reflete as mudanças observadas na MO, observamos aumento na frequência de LSK (LinSca-1 + c-Kit+ ), progenitores multipotentes (LSK, CD135+ ) e LK (LinSca-1 - ) e redução na frequência de progenitores mielóides comuns (CMP) e progenitores de granulócitos/macrófagos (GMP) nos animias-4T1, enquanto que nos animais-67NR foi observada somente uma redução dos CMPs. Para investigar a influência das células T nessas alterações, células T naives ou T-4T1 foram transferidas para camundongos NUDEs. Aqueles que receberam células T-4T1 apresentaram maior número de neutrófilos no SP e aumento na frequência de LSK, LK, CMP e diminuição de GMP na MO. Curiosamente, quando as células T foram separadas em CD4 e CD8, este efeito foi mais evidente para as células T CD4+ 4T1. Além disso, células T apresentam diferenças fenotípicas entre estes animais. Na MO de camundongos-67NR há prevalência de células T CD8 de memória efetora, já nos animais-4T1linfócitos T CD8 naive, efetores e de memória central. Esses linfócitos T produzem e secretam citocinas que estabelecem o microambiente que favorecem a neutropoiese em camundongos-4T1 e a monopoiese em camundongos-67NR. Esse mecanismo foi confirmado pelo ensaio CFU no qual foi utilizado meio condicionado de células T ativadas para antígenos tumorais. Meio condicionado de células T 67NR induziu a diferenciação de células com morfologia monocítica, em contraste, para células T 4T1 que apresentaram colônias com morfologia neutrofílica. Em conjunto, esses dados sugerem que células T primadas para antígenos tumorais são capazes de regular a hematopoiese de acordo com a natureza do tumor de mama. Esta atividade parece ser, principalmente, determinada por células T CD4 que licenciam a diferenciação mieloide, levando a alterações na composição de SP e diminuição de precursores mielóides na MO.

Palavras-chave: LINFOCITOS T; CD4

As in other systemic inflammatory disorders, during tumor progression, there is a great demand of hematopoietic cells which are crucial for tumor development being part of the primary as well as of the metastatic microenvironment. Although adaptive immune cells respond to efficient antigen presentation with activation and proliferation, innate immune cells need to be replenished from progenitor cells, in a process called emergency hematopoiesis. In previous work we demonstrated that the T cells are essential to maintain the “homeostatic” hematopoiesis. However, how T cells contributes to demand-hematopoiesis evoked during murine breast cancer progression has not yet been investigated. To analyze this, female BALB/c mice were orthotopically inoculated with 4T1 syngeneic metastatic tumor cells or 67NR nonmetastatic cells and the bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) cells were evaluated. We observed that metastatic and non-metastatic tumors induce different changes in the hematopoietic compartment. While 4T1 bearing mice accumulate neutrophils in PB, 67NR bearing mice was accumulate monocyte/macrophages. The PB profile reflects changes observed in the BM as an increase in frequency of LSK (LinSca-1 + c-Kit+ ), multipotent progenitors cells (LSK, CD135+ ) and LK (LinSca-1 - c-Kit+ ) in both tumor bearing mice was observed. BM of 4T1 bearing mice showed a decrease in frequency of common myeloid progenitors (CMP) and granulocyte/macrophage progenitors (GMP), while in 67NR bearing a decrease only in CMP was observed. To investigate the influence of T cells in these hematopoietic changes, naïve T cells or 4T1 primed-T cells were adoptively transferred into NUDE mice. The mice that received 4T1 primed-T cells displayed higher number of neutrophils in the PB and increased in frequency of LSC, LK, CMP and decreased GMP in the BM compared to mice that received naïve T cells. Interestingly, when the T cells were sorted into CD4 and CD8, these effect were more evident in 4T1 primed CD4+ T cells. Also, were observed great differences in T cells phenotypes among these animals. In BM of 67NR bearing was prevalent CD8 effector memory T cells and in 4T1 bearing CD8 naïve, effector and central memory T cells. Moreover, these T lymphocytes produce and secrete cytokines that in turn establish a microenvironment that favor neutropoiesis in 4T1 mice and monopoiesis in 67NR mice, confirmed by a CFU assay using conditioned media from 67NR primed-T cells wich induced differentiation of monocytic cell, in contrast, the colonies formed from conditioned media of 4T1 primed-T cells showed a granulocytic lineage morphology. Together our data suggest that tumor-primed T cells are able to regulated hematopoiesis differentially according to the nature of the mammary tumor. This activity seems to be mainly determined by CD4 T cells, which license myeloid differentiation, leading to changes in PB composition and BM diminution of myeloid precursors.

Key words: CD4 T CELLS

Título: Agregação de proteínas induzida pelo estresse oxidativo promovido pelo Heme
Aluno(a): Luiz Ricardo da costa Vasconcellos
Orientador(es): Prof. Leonardo Holanda Travassos Correa

Agregação de proteínas induzida pelo estresse oxidativo promovido pelo Heme A liberação do heme em sua forma livre exerce papel crucial na patogênese de várias doenças importantes em humanos tais como a malária, a sepse, febre hemorrágica e hemorragia cerebral. O heme é caracterizado como uma molécula com potencial pró-inflamatório e citotóxico induzindo a liberação de mediadores inflamatórios por ativação de TLR4 e de inflamossomo NLRP3 assim como a morte por necroptose em macrófagos. Em virtude dos efeitos deletérios induzidos pelo heme, uma resposta homeostática é desencadeada na célula para lidar com o estresse exercido minimizando o desequilíbrio. Neste trabalho é demonstrado, pela primeira vez, uma resposta celular de agregação de p62 contendo proteínas ubiquitinadas em compartimento denominado ALIS no estímulo com heme. A formação destes agregados possui característica transiente e é degradada através de autofagia. Além disso, é demonstrado que a formação de ALIS é dependente da geração de ROS promovida pelo estímulo com heme que induz a ativação de NRF2 resultando na expressão de genes envolvidos em respostas citoprotetoras, incluindo o p62. Apesar de dependente da geração de ROS é demonstrado que esta agregação de proteínas ocorre de maneira independente de sinalização via TLR4. Em contrapartida, a geração de ALIS depende da ativação das MAPKs e da síntese de novo de proteínas. É demonstrado também que a degradação do heme via HO-1 é fundamental para a indução de ALIS, sendo o Fe liberado por este processo o componente mínimo requerido para a indução de ALIS. Mais do que isso o estímulo com Fe recapitula os efeitos do heme na agregação de proteínas sendo a conversão de Fe+2 para Fe+3 e seu estoque pelo sistema Ft fundamental para o controle da indução de ALIS pelo Fe. De forma relevante, fontes de heme presentes no organismo, como a Hb e hemácias, induzem a formação de ALIS in vitro. Finalmente, é observada a formação de ALIS em baço e fígado extraídos de animais submetidos à hemólise severa demonstrando a indução de agregados de proteínas in vivo. Em conjunto, estes dados caracterizam um mecanismo celular ainda pouco explorado na literatura que pode ser importante para os efeitos inflamatórios e citotóxicos exercidos pelo heme e pelo Fe liberado em doenças hemolíticas.

Palavras-chave: Heme, Autofagia, Agregados de proteínas, ALIS, estresse oxidativo, espécies reativas de oxigênio, Heme-oxigenase

Heme induces protein aggregation through oxidative stress Free heme release is crucial to the pathogenesis of several important diseases in humans such as malaria, sepsis, hemorrhagic fevers and cerebral hemorrhage. Heme has been characterized as a potential inflammatory and cytotoxic molecule triggering the release of inflammatory mediators through TLR4 and NLRP3 inflammasome activation as well as inducing necroptosis in a TNF mediated manner in macrophages. Homeostatic response is triggered in the cell upon heme stimulus to cope with deleterious effects and minimize the imbalance induced triggered by generalized oxidation. Here is described, for the first time, a p62 aggregation response which contains ubiquitinated proteins compartimentalized in ALIS upon heme stimulus. The aggregates inducted have transient property and are degraded through autophagy. Furthermore, ALIS formation depends on ROS generation which activates Nrf2 and results in expression of genes involved in antioxidant response, including p62. Although ALIS formation depends on ROS generation it is independent of TLR4 signalling. Conversely, ALIS generation depends on MAPKs activation and de novo protein synthesis. Furthermore, is demonstrated that heme degradation is required for protein aggregation and labil iron release is the minimum element required to trigger ALIS. Even more, iron stimulus recapitulates the effects of heme in ALIS formation and the conversion of Fe+2 para Fe+3 and the iron stock within Ft complex is essential for ALIS excess control. Relevantly, heme sources as Hb and red blood cells also induce ALIS formation in vitro. Finally, hemolysis triggered by PHZ induces ALIS in target tissues in vivo. Together, these data characterize the cellular mechanism of protein aggregation that might be important for inflammatory and cytotoxic effects of heme and free iron during hemolytic diseases.

Key-words: Heme, Autophagy, Protein aggregates, ALIS, oxidative stress, oxygen reactive species, Heme-oxigenase

Título: Análise fenotípica de macrófagos e linfócitos t cd8 após a inibição da apoptose de células t na doença de chagas experimenta.
Aluno(a): Mariela Pires Cabral Piccin
Orientador(es): Prof^a Marcela de Freitas Lopes

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Durante a infecção, observa-se morte por apoptose de linfócitos, o que prejudica a imunidade contra o parasita, e eferocitose, que leva ao aumento da carga parasitária em macrófagos. Estudos prévios mostram que o uso de inibidores da apoptose (zVAD ou anti-FasL) melhoram a imunidade contra o T. cruzi, aumentando a sobrevivência de linfócitos T CD8 e a resposta de macrófagos. Entretanto, ainda permanece por ser esclarecido se o bloqueio da apoptose altera o fenótipo de macrófagos e impacta na função de linfócitos T CD8. O objetivo deste estudo foi analisar o fenótipo de macrófagos e linfócitos T CD8 após a inibição da apoptose de células T na doença de Chagas experimental. Camundongos BALB/c foram infectados e experimentos utilizando anti-FasL ou zVAD foram realizados, in vitro e in vivo. Linfócitos T CD8 e macrófagos inflamatórios são as principais células recrutadas para o peritônio durante a fase aguda da infecção. Além disso, observou-se também que enquanto animais normais apresentavam macrófagos do tipo M2, animais infectados apresentaram iguais proporções de macrófagos M1 e M2. O tratamento com anti-FasL preveniu a apoptose de linfócitos, aumentou a produção de NO e reduziu a infecção em macrófagos co-cultivados com células T CD8 ativadas. Resultados similares foram observados a partir do tratamento in vivo com antiFasL, o que também reduziu o perfil M2 em macrófagos e alterou o perfil de secreção de citocinas e quimiocinas. Padrões semelhantes de respostas foram observados em culturas tratadas com zVAD ou em camundongos infectados que receberam linfócitos ativados previamente tratados com zVAD. No que diz respeito aos linfócitos, o T. cruzi recruta células T CD8 CD44+CD62L-CD127- , correspondente ao fenótipo efetor, bem como recruta células T CD8 antígeno-específicas. Além disso, uma proporção de células T CD8 recrutadas para o peritônio de animais infectados expressam IFN-γ e TNF-α. Quando estimuladas, in vitro, com o peptídeo da transialidase IYNVGQVSI e tratadas com anti-FasL, as células T CD8 apresentaram maior expressão de IFN-γ e perforina que culturas tratadas com o isotipo controle IgG, evidenciando, assim, que a inibição da apoptose poderia resgatar células T CD8 funcionais. Na presença do peptídeo, o tratamento com anti-FasL também diminuiu a viabilidade dos macrófagos. Mesmo assim, culturas estimuladas com peptídeo apresentaram uma maior produção de NO após o tratamento com anti-FasL. Em resumo, a inibição da apoptose tem a capacidade de aumentar a resposta M1 de macrófagos, bem como aumentar o número de células T CD8 produtoras de IFN-γ e perforina na fase aguda da doença de Chagas experimental..

Palavras-chave: doença de Chagas; Trymanosoma cruzi; eferocitose;a poptose;l infócitos T CD8; macrófagos

Chagas disease is an infectious disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. In the course of infection, lymphocytes undergo apoptosis, which dampens immunity against the parasite, and efferocytosis increases parasitic burden within macrophages. Previous data show that apoptosis inhibitors, such as zVAD and anti-FasL, improves immune responses to T. cruzi, increasing CD8 T cell survival and macrophage response. It remains unknown whether apoptosis blockade change macrophage phenotypes and impact CD8 T cell function. The aim of this study was to analyze the phenotypes of macrophages and CD8 T lymphocytes after apoptosis inhibition in experimental Chagas disease. BALB/c mice were infected and experiments were performed by using anti-FasL and zVAD, both in vitro and in vivo. CD8 T lymphocytes and inflammatory macrophages were the main cells recruited to the peritoneum of infected mice during the acute phase of infection. Moreover, wherea;s macrophages from non-infected mice displayed an M2 phenotype, infected mice presented equal proportions of M1 and M2 macrophages. Treatment with anti-FasL prevented lymphocyte apoptosis, increased NO production and reduced T. cruzi infection in macrophages co-cultured with activated CD8 T cells. Similar results were observed upon treatment with anti-FasL in vivo, which also decreased M2 macrophages and changed the profile of secreted cytokine and chemokine. Similar results were also obtained in cultures treated with zVAD or when infected mice received activated T cells previously treated with zVAD. Regarding CD8 T lymphocytes, T. cruzi infection recruited CD8 T cells with the CD44+CD62L-CD127- effector phenotype, as well as antigen-specific CD8 T cells. In addition, a proportion of peritoneal CD8 T cells of infected mice express both IFN-γ and TNF-α. When stimulated in vitro with the transialidase peptide IYNVGQVSI and treated with anti-FasL, CD8 T cells showed higher expression of IFN-γ and Perforin than cultures treated with control IgG. In the presence of the peptide, treatment with anti-FasL also reduced macrophage viability. On the other hand, cultures that were stimulated with the peptide showed higher production of NO when treated with anti-FasL. To summarize, apoptosis inhibition is able to improve M1 responses by macrophages and increase effector CD8 T cells producing both IFN-γ and perforin during the acute phase of experimental

Key words: Chagas disease; Trypanosoma cruzi; apoptosis; CD8 T lymphocytes;macrophages; efferocytosis

Título: Eficácia vacinal do LaAg associado com adjuvantes contra infecção por Leishmania amazonensis.
Aluno(a): Mirian Franca de Mello
Orientador(es): Prof. Herbert Leonel de Matos Guedes

A vacina composta pelo lisado total de Leismania amazonensis (Leishvaccine ou LaAg) é uma das vacinas mais estudadas contra a leishmaniose. Esta vacina foi avaliada em testes clínicos e apesar de ser segura e induzir Interferon-gamma, ela falhou em testes de fase 3 para comprovar a sua eficácia. Com o desenvolvimento de novos adjuvantes, buscando a reposição desta vacina, nós propomos associar a vacina LaAg com diferentes adjuvantes buscando o aumento da eficácia protetora. Primeiramente, realizamos os experimentos em camundongos suscetíveis BALB/c. Nós empregamos o teste de hipersensibilidade cutânea como parâmetro inicial para seleção do adjuvante de escolha. Nós associamos LaAg com Adjuvante completo de Freud ou Addavacxs ou Saponina e imunizamos os camundongos duas vezes, como controle usamos PBS e LaAg sozinho. Usando o LaAg como desafio, o único adjuvante capaz de induzir hipersensibilidade foi a Saponina. Em seguida, nós avaliamos a capacidade de induzir eficácia protetora da associação de LaAg com saponina. Nós observamos que a vacinação com LaAg+SAP induziu proteção parcial controlando parcialmento o controle da lesão e da carga parasitária, diferentemente do LaAg que apresentou uma tendência em aumentar a suscetibilidade da infecção. Avaliando animais imunizados e animais imunizados e infectados nós observamos a produção de células produtoras de interferon-gamma. Nós observamos o aumento de iNOS no sitio da infecção 18 horas após o desafio, sugerindo um possível mecanismo para o controle da lesão e da carga parasitária. Além disso, avaliando o sítio da infecção 18 horas após o desafio, nós observamos o recrutamento de linfócitos, macrófagos, neutrófilos e eosinófilos no grupo LaAg+SAP. Buscando compreender o papel dos eosinófilos, nós os bloqueamos com anti-CCR3 e anti-iL5. Independente da depleção de eosinófilos, a vacina induziu proteção. Em seguido, avaliamos a vacina LaAg+Sap em camundongos parcialmente resistente, C57Bl6. Surpreendentemente, apesar de induzir hipersensibilidade de maneira similar, a vacina falhou em induzir imunidade protetora. Nós observamos, que a vacina induziu uma resposta mista Th1 e Th2, produzindo células produtoras de Interferon-gamma e IL4. Esta resposta mista provavelmente está relacionada com a falha da vacina. Desta forma, concluímos que o uso de adjuvante pode modular a resposta imune de vacinas aumentando a eficácia protetora, entretanto, o uso de diferentes modelos para estudos pré-clínicos é importante para a validação de um candidato vacinal.

Palavras-chave: trans Leishmania amazonensis; Vacina 3; LaAg 4; Saponina

A vacina composta pelo lisado total de Leismania amazonensis (Leishvaccine ou LaAg) é uma das vacinas mais estudadas contra a leishmaniose. Esta vacina foi avaliada em testes clínicos e apesar de ser segura e induzir Interferon-gamma, ela falhou em testes de fase 3 para comprovar a sua eficácia. Com o desenvolvimento de novos adjuvantes, buscando a reposição desta vacina, nós propomos associar a vacina LaAg com diferentes adjuvantes buscando o aumento da eficácia protetora. Primeiramente, realizamos os experimentos em camundongos suscetíveis BALB/c. Nós empregamos o teste de hipersensibilidade cutânea como parâmetro inicial para seleção do adjuvante de escolha. Nós associamos LaAg com Adjuvante completo de Freud ou Addavacxs ou Saponina e imunizamos os camundongos duas vezes, como controle usamos PBS e LaAg sozinho. Usando o LaAg como desafio, o único adjuvante capaz de induzir hipersensibilidade foi a Saponina. Em seguida, nós avaliamos a capacidade de induzir eficácia protetora da associação de LaAg com saponina. Nós observamos que a vacinação com LaAg+SAP induziu proteção parcial controlando parcialmento o controle da lesão e da carga parasitária, diferentemente do LaAg que apresentou uma tendência em aumentar a suscetibilidade da infecção. Avaliando animais imunizados e animais imunizados e infectados nós observamos a produção de células produtoras de interferon-gamma. Nós observamos o aumento de iNOS no sitio da infecção 18 horas após o desafio, sugerindo um possível mecanismo para o controle da lesão e da carga parasitária. Além disso, avaliando o sítio da infecção 18 horas após o desafio, nós observamos o recrutamento de linfócitos, macrófagos, neutrófilos e eosinófilos no grupo LaAg+SAP. Buscando compreender o papel dos eosinófilos, nós os bloqueamos com anti-CCR3 e anti-iL5. Independente da depleção de eosinófilos, a vacina induziu proteção. Em seguido, avaliamos a vacina LaAg+Sap em camundongos parcialmente resistente, C57Bl6. Surpreendentemente, apesar de induzir hipersensibilidade de maneira similar, a vacina falhou em induzir imunidade protetora. Nós observamos, que a vacina induziu uma resposta mista Th1 e Th2, produzindo células produtoras de Interferon-gamma e IL4. Esta resposta mista provavelmente está relacionada com a falha da vacina. Desta forma, concluímos que o uso de adjuvante pode modular a resposta imune de vacinas aumentando a eficácia protetora, entretanto, o uso de diferentes modelos para estudos pré-clínicos é importante para a validação de um candidato vacinal.

Palavras-chave: Leishmania amazonensis; Vacina 3; LaAg 4; Saponina

Título: Resolvina reverte fibrose pulmonar em modelo murino de bleomicina.
Aluno(a): Rafael de Freitas Guilherme
Orientador(es): Prof^a Claudia Farias Benjamim

A fibrose pulmonar idiopática é uma doença devastadora caracterizada pelo exacerbado depósito de colágeno e consequente perda da estrutura pulmonar. Após o seu diagnóstico, a sobrevida dos pacientes é de três a cinco anos e nenhuma terapia eficaz tem se mostrado disponível, reforçando a necessidade de novas estratégias de tratamento. A este respeito, as resolvinas (Rvs) e os seus análogos, derivados o ácido graxo ômega-3, com potentes efeitos anti-inflamatório e próresolução, surgem como potenciais substâncias de interesse clínico. Nesse trabalho utilizamos o tratamento com a ATRvD1 no 7° e 10° dia e coletamos as amostras no 7º e 14° dia após a injeção da bleomicina (BLM). Os nossos resultados demonstram que a ATRvD1 reverteu o processo fibrótico já estabelecido sendo administrado uma semana após a indução da fibrose. Por meio de análise histológica, observamos que a ATRvD1 reverteu a inflamação e a deposição de colagéno total, colágeno tipo 1, e estimulou o reparo tecidual pela reestruturação da arquitetura pulmonar. A ATRvD1 também inibiu o acúmulo celular induzido pela BLM no parênquima pulmonar e no lavado broncoalveolar (BAL), bem como diminuiu a liberação de citocinas relacionadas com a evolução da fibrose. A ATRvD1 mostrou efeito na modulação de miofibroblastos, diminuindo seu principal marcador α-SMA in vivo e in vitro , sua proliferação, e a liberação de citocinas. Além disso, a ATRvD1 reduziu a liberação de TGF-β, MMP-9 e Timp-1 na cocultura de fibroblastos e macrófagos. Ademais, o análogo restaurou o fenótipo de macrófagos para um perfil menos inflamatório e reduziu a liberação de micropartículas in vivo e in vitro. Tomados em conjunto, nossos dados indicam e reforçam o uso do ATRvD1 como um promissor agente terapêutico para o tratamento de doenças pulmonares fibróticas.

Palavras-chave: Fibrose; FPI; Resolvina; ATRvD1; Pulmão; Inflamação

Idiophatic pulmonary fibrosis is a devastating disease characterized by exacerbated collagen deposition and loss of lung structure. After diagnosis, patient survival is three to five years, and no effective therapy has been shown to be available, reinforcing the need for new treatment strategies. In this regard, resolvins (Rvs) and their analogs, derived from omega-3 fatty acid, with potent antiinflammatory and pro-resolution effects, appear as potential substances of clinical interest. In this study we used ATRvD1 as treatment on the 7th and 10th day and we collected the samples on the 7th and 14th day after bleomycin injection (BLM). Our results demonstrate that the ATRvD1 reversed the already established fibrotic process being administered one week after the induction of fibrosis. Through histological analysis, we observed that ATRvD1 reversed the inflammation and the deposition of total collagen, type 1 collagen, and stimulated the tissue repair by restructuring the pulmonary architecture. ATRvD1 also inhibited BLM- induced cellular accumulation in the pulmonary parenchyma and bronchoalveolar lavage (BAL), as well as decreased the release of cytokines related to the fibrosis evolution. ATRvD1 showed an effect on the modulation of myofibroblasts, decreasing its main α-SMA marker in vivo and in vitro, its proliferation, and the release of cytokines. In addition, ATRvD1 reduced the release of TGF-β, MMP-9 and Timp-1 in the co-culture of fibroblasts and macrophages. In addition, the analogue restored the macrophage phenotype to a less inflammatory profile and reduced the release of microparticles in vivo and in vitro. Taken together, our data indicate and reinforce the use of ATRvD1 as a promising therapeutic agent for the treatment of fibrotic lung diseases.

Key words: Fibrosis; IPF; Resolvin; ATRvD1; Lung; Inflammation

Título: Avaliação da resposta imune anti-HIV: desenvolvimento de vacina e estudo da ativação imune crônica.
Aluno(a): Carolina Goncalves de Oliveira Lucas
Orientador(es): Prof^a Luciana Barros de Arruda

A infecção por HIV está associada à depleção de linfócitos TCD4+ e disfunção de diferentes compartimentos do sistema imune. O desenvolvimento de imunoterapias, visando à recuperação imune dos pacientes HIV+ é uma das estratégias propostas para indução de resposta imune vírus-específica e controle da infecção. Por outro lado, a ativação imune generalizada está correlacionada com a progressão para a AIDS. Proliferação de células T e um aumento de expressão dos marcadores de ativação são observados em células T vírus-específicas, mas também em células não específicas, sugerindo ativação bystander dessas células durante a infecção crônica pelo HIV. Nesta tese abordaremos esses dois aspectos da infecção por HIV: (i) o desenvolvimento de novas estratégias de imunoterapia; e (ii) o papel de um dos mediadores inflamatórios, cuja expressão é aumentada em pacientes crônicos, na ativação inespecífica de linfócitos T e células NK. Na primeira parte da tese avaliamos uma vacina (mLg-DC) baseada na utilização de células dendríticas (DC) primárias transfectadas com a quimera de DNA plasmidial LAMP/gag, previamente analisada por nosso grupo. Diferentes estratégias baseadas no uso de DCs como veículo vacinal têm sido avaliadas no contexto da infecção por HIV; no entanto uma comparação entre as mesmas não é realizado de forma sistemática e um protocolo ótimo de vacinação ainda não é conhecido. Nossos dados demonstraram que a imunização de camundongos com a vacina mLg-DC gera potente e prolongada resposta imune, sistêmica e de mucosa, mediada por células TCD4+, TCD8+ e células B. Esta abordagem parece ser mais efetiva do que outras estratégias que vem sendo utilizadas, incluindo o uso de DCs transfectadas com gag nativa ou pulsadas com HIV inativado. Além disso, DCs humanas transfectadas com LAMP/gag induziram potente resposta imune Gag-específica, mediada por linfócitos T obtidos de pacientes HIV+, demonstrando o potencial de Lg-DCs como uma nova estratégia de vacinação contra o HIV. Na segunda parte da tese, investigamos o papel da IL-15 na ativação inespecífica de linfócitos T e células NK, obtidas de doadores saudáveis e pacientes HIV+. Níveis elevados de IL-15 são observados em pacientes HIV+, e esta citocina é produzida por DCs ativadas por ligantes de TLR, como LPS, cujos níveis circulantes estão também aumentados nesses pacientes. Estudos anteriores sugeriram que a IL-15 ativa linfócitos TCD8+, de maneira antígeno-independente, sugerindo que a citocina pode estar envolvida na ativação imune crônica, bystander, na infecção por HIV. Neste estudo foi demonstrado que a IL-15 estimula células NK e ativa células TCD4+ e TCD8+ de forma antígeno-independente. Foi observado um aumento da expressão de marcadores de ativação, aumento de proliferação e de atividade citotóxica por todos os tipos celulares avaliados, obtidos de doadores HIV- e HIV+. Além disso, demonstramos que DC ativadas por LPS estimulam linfócitos TCD4+, TCD8+ e células NK, de maneira dependente de IL-15 e independente de antígeno, sugerindo que esse pode ser um dos mecanismos envolvidos na ativação bystander de células T, e pode contribuir para a ativação imune crônica observada durante a infecção pelo HIV.

Palavras-chave: HIV;Células NK;TCD4

HIV infection is associated with CD4+ T cells depletion and impairment of different compartments of the immune system. The development of immunotherapies, aiming the immune recovery of HIV+ patients is one of the proposed strategies for induction of virus-specific immune response and infection control. On the other hand, general immune activation correlates with AIDS progression. Proliferation of T cells and increase expression of activation markers are observed in virus-specific T cells but also in non-specific cells, suggesting bystander activation during chronic HIV infection. At this thesis we discuss these two aspects of HIV infection: (i) the development of new immunotherapy strategies; and (ii) the role of the inflammatory mediators whose expression is increased in chronic patients in non-specific activation of T lymphocytes and NK cells. At the first part of this thesis we evaluated a vaccine (mLg-DC) based on the use of primary dendritic cells (DC) transfected with the plasmid DNA chimera LAMP/ gag, previously analyzed by our group. Different strategies based on the use of DCs as a vaccine vehicle have been evaluated in the context of HIV infection; however a comparison between them is not carried out systematically and the vaccination protocol is not known yet. Our data demonstrate that mice immunization with the mLg-DC vaccine generates potent and prolonged immune response, systemic and at mucosal, mediated by CD4+/CD8+ T and B cells. This approach seems to be more effective than others strategies that have been used, including the use of DCs transfected with native gag or pulsed with inactivated HIV. In addition, human DCs transfected with LAMP/gag induced potent immune response, Gag-specific, mediated by T lymphocytes obtained from HIV+ patients, demonstrating the potential of Lg-DC as a new vaccination strategy against HIV. At the second part of this thesis, we investigated the role of IL-15 in non-specific activation of T lymphocytes and NK cells obtained from healthy donors and HIV+ patients. Elevated levels of IL-15 are observed in HIV+ patients, and this cytokine is produced by activated DCs by TLR ligands such as LPS, whose circulating levels are also increased in these patients. Previous studies have suggested that IL-15 activates CD8 T cells in an antigen-independent manner, suggesting that this cytokine may be involved in chronic immune activation, bystander, in HIV infection. This study demonstrated that IL-15 stimulates NK cells and activates CD4 and CD8 T cells in an antigen-independent manner. An increased expression of activation markers was observed, increased proliferation and cytotoxicity activity by all cell types assessed, obtained from HIV- and HIV+ donors. Furthermore, we demonstrate that DC activated by LPS stimulate CD4, CD8 T cells and NK cells dependent of IL-15 but in an antigen-independent manner, suggesting that this may be one of the mechanisms involved in bystander T-cell activation, and may contribute to chronic immune activation observed during HIV infection.

Palavras-chave: HIV; NK CELLS; TCD4

Título: Avaliação da expressão e do papel da proteína príon celular na infecção pelo HTLV-1.
Aluno(a): Isabela Silva de Castro
Orientador(es): Prof^a Juliana Echevarria Neves de Lima

A infecção causada pelo vírus linfotrópico de células T humano do tipo 1 (HTLV-1), vírus endêmico no Brasil, pode induzir diversas manifestações clínicas de caráter inflamatório, inclusive a mielopatia associada a infecção pelo HTLV-1/paraparesia espástica tropical (MAH/PET). A MAH/PET é uma manifestação clínica grave considerada uma doença neuroinflamatória crônica que, em longo prazo, pode levar a perda da capacidade motora. Ainda assim, permanecem desconhecidos os mecanismos pelos quais a doença tem início ou o que induz o portador do vírus a progredir de um estado assintomático para o estado de neuroinflamação. Por outro lado, estudos têm demonstrado que a proteína príon celular (PrPc) é expressa em células do sistema imune e pode ser regulada durante processos inflamatórios e infecciosos, incluindo infecções virais. Sendo assim, foi avaliada a expressão de PrPc e seu possível papel em linfócitos de indivíduos infectados, bem como em linhagens células linfoides T, permanentemente infectadas pelo HTLV-1. Foi observado que tanto as células T CD4+ e CD8+ dos indivíduos infectados, quanto as linhagens celulares infectadas, expressam redução na porcentagem de células PrPc positivas, bem como, reduzida expressão da proteína na superfície celular. Ao investigarmos a natureza da regulação negativa de PrPc, foram detectados níveis de RNA diminuídos para a proteína apenas em células CD4+ de indivíduos assintomáticos. Como a PrPc pode sofrer clivagem por ADAMs (metaloproteinases com domínio desintegrina), mesmo em condições fisiológicas, foi avaliado na presença de MnCl2, pois o metal é capaz de aumentar a atividade catalítica de algumas metaloproteinases. Observamos em células C91 (linhagem permanentemente infectada) que o MnCl2 acentuou a diminuição da expressão de PrPc. Além disso, detectamos a presença de quantidades significativamente maiores de fragmentos de PrPc no soro de indivíduos infectados. A infecção está diretamente relacionada com a diminuição de PrPc. Sugerimos que esse seja um efeito da atividade da proteína viral p12, visto que células transfectadas com o plasmídeo mutante capaz de gerar altos níveis de p12 promove a redução da PrPc, e na ausência de p12 o fenômeno não foi observado. No entanto, os linfócitos T CD8+, que não são o principal alvo para a infecção, também apresentam uma redução na expressão de PrPc. As células T CD8+ PrPc negativas de indivíduos infectados apresentam aumento na expressão de CD25+e produção de IFN e granzima B, sugerindo que estas células apresentam um perfil de células ativadas. Desta forma, pode-se sugerir que a PrPc possa exercer um papel na infecção pelo HTLV-1, pois podem estar associadas ao controle da infecção ou ao desenvolvimento de doenças associadas à infecção.

Palavras-chave: htlv;PRÍON

The infection caused by the human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1), an endemic virus in Brazil, can induce many different clinical manifestations of inflammatory nature, including myelopathy associated to HTLV-1 / tropical spastic paraparesis (HAM/ TSP). The HAM/TSP is a severe clinical manifestation considered to be a chronic neuroinflammatory disease that, in long term, can lead to loss of motor ability. Nonetheless, the mechanisms by which the disease begins or what causes the carrier of the virus to progress from asymptomatic to neuroinflammation status remain unknown. More recently studies have shown that cellular prion protein (PrPc) is expressed in the immune system cells and can be regulated during inflammatory and infectious diseases, including viral infections. Thus, the expression of PrPc and its possible during HTLV-1 infection was assessed in lymphocytes from infected patients as well as T lymphoid cell lines permanently infected with HTLV-1. It was observed that CD4 + and CD8 + T cells from infected subjects, as well as the infected cell lines, expressed reduced percentage of PrPc-positive cells and reduced expression of the protein in the cell surface. When investigating the nature of PrPc downregulation, we showed that the PrPc RNA levels are decreased only in CD4 + cells from asymptomatic individuals. As PrPc can be cleaved by ADAMs (metalloproteinase with disintegrin domain) even under physiological conditions, it was evaluated if the presence of MnCl2, would interfere in PrPc expression since the metal is capable of increasing the catalytic activity of some metalloproteinases. We observed that in C91 cells (permanently infected strain) MnCl2 further reduced PrPc expression. Moreover, we detected the presence of significantly higher quantities of PrPc fragments in serum of infected subjects. The infection is directly related to PrPC reduction. We suggest this is an effect of the viral protein p12 activity, since cells transfected with a mutant plasmid capable of generating high levels of p12 promotes the reduction of PrPc and in the absence of p12 the phenomenon was not observed. Although CD8+ T cells are not the primary target for infection, they also showed a reduction in PrPc expression. CD8+ T PrPc Negative cells from infected individuals exhibited increased expression of CD25+ and production of granzyme B and IFNγ, suggesting that these cells have an activated cell profile. Thus, we can suggest that PrPc may play a role in HTLV-1 infection, as they it may be associated with the control of the infection or with the development of diseases associated with HTLV-1 infection.

Palavras-chave: htlv;PRÍON

Título: Dinâmica de renovação das células t reguladoras CD4+ Foxp3+ no compartimento periférico.
Aluno(a): Jeane de Souza Nogueira
Orientador(es): Prof^a Maria Bellio

As células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg) constituem uma importante subpopulação de linfócitos T CD4+ envolvida no estabelecimento da auto-tolerância e na regulação de diversas respostas imunológicas a antígenos não-próprios e na homeostase periférica dos linfócitos T. Esta subpopulação é composta por células Foxp3+ naturais de origem intratímica (nTreg) e por células Treg perifericamente induzidas diferenciadas de células T convencionais Foxp3-(iTreg). A sua frequência nos órgãos linfoides periféricos é mantida estável nos indivíduos jovens, sugerindo que uma competição por persistência periférica deve existir entre as células Treg residentes, sejam elas naturais ou induzidas, e as células Treg que emigram continuamente do timo. As regras que determinam a sobrevivência e a substituição das células Treg na periferia ainda não foram totalmente elucidadas. Neste trabalho, analisamos a dinâmica de renovação periférica das células Treg comparada à das células T convencionais CD4+ Foxp3- (Tconv). Inicialmente confirmamos os resultados obtidos previamente em minha dissertação de mestrado, utilizando protocolos de transferências sucessivas de timócitos ou esplenócitos de doadores congênicos para hospedeiros linforrepletos ou linfopênicos, onde uma incorporação preferencial de células Treg, comparada as células Tconv, foi observada. Verificamos que esta maior renovação na população de células Treg correlacionouse com taxas aumentadas de proliferação das células Treg que chegam na periferia e maior taxa de morte das células Treg residentes quando o ambiente é linforrepleto. A dinâmica de renovação de ambas as subpopulações (Treg e Tconv) foi resistente às alterações ambientais temporárias induzidas por inflamação ou mudanças na microbiota. Surpreendentemente, em hospedeiros RAG2-/- , esta substituição XI preferencial de células Treg não foi observada, sugerindo uma dependência dos linfócitos B. A transferência semanal de células B para estes hospedeiros recuperou a incorporação preferencial de células Treg, indicando um novo aspecto dos linfócitos B em regular a homeostase periférica dos linfócitos T recém chegados. O melhor conhecimento da dinâmica de renovação periférica das células Treg poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas adequadas, envolvendo a utilização de células Treg, para restaurar a auto tolerância em doenças autoimunes ou regular respostas imunológicas contra antígenos não-próprios.

Palavras-chave: células T reguladoras; células T convencionais; compartimento periférico; dinâmica de renovação;nicho;competição; homeostase

CD4+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg) belong to an important subset of CD4 lymphocytes involved in the establishment of self-tolerance and in the regulation of many immune responses to nonself antigens and of peripheral T cell homeostasis. This subset is composed by natural intra thymic Foxp3+ cells (nTreg) and by peripherally induced Treg cells differentiated from the conventional Foxp3- T cells (iTreg). Their frequency of Treg cells is kept stable in young individuals, suggesting that a competition for peripheral persistence may exist between natural or induced residents Treg cells, and those continuously emigrating from the thymus. The rules determining the survival and replacement of Treg cells in the periphery are not totally elucidated. In this study, we analyzed the dynamics of peripheral renewal of Treg cells compared to that of conventional CD4+ Foxp3- T cells (Tconv). We first confirmed the results previously obtained during my master thesis, using protocols of thymocytes or splenocytes successive transfers derived from congenic donors to normal or lymphopenic hosts, where a preferential incorporation of Treg cells, compared to Tconv cells, was seen. We then verified that the enhanced renewal in the Treg population was associated with their increased rates of proliferation, and with a higher rate of death when these Treg cells ingress into a fully colonized environment. The renewal dynamics of both subsets (Treg and Tconv) was resistant to temporary environmental changes induced by inflammation or microbiota shifts. Surprisingly, in the RAG2-/- hosts the favored substitution of Treg cells was not observed, suggesting its dependence on B lymphocytes. The weekly transfer of B lymphocytes to these hosts recovered the preferential incorporation of Treg cells, indicating a new aspect of B cells in the regulation of peripheral homeostasis of XIII recently arrived T lymphocytes. This study may help to develop appropriate therapeutic strategies, involving Treg cells manipulation, in order to restore selftolerance in autoimmune diseases or to regulate immune responses to nonself antigens.

Palavras-chave: regulatory T cells; conventional T cells; niches; homeostasis; peripheral compartment; renewal dynamics; competition

Título: DINÂMICA DE RENOVAÇÃO DAS CÉLULAS T REGULADORAS CD4+ Foxp3+ NO COMPARTIMENTO PERIFÉRICO.

Aluno(a): JEANE DE SOUZA NOGUEIRA

Orientador(es): Prof(a). MARIA BELLIO

Título: ATRvD1 atenua a lesão renal aguda pós-sepse em camundongos
Aluno(a): Jose Bruno Nunes Ferreira Silva
Orientador(es): Prof^a Claudia Farias Benjamim

Sepse é uma síndrome inflamatória, metabólica e sistêmica onde observa-se uma resposta desregulada do hospedeiro ao estímulo infeccioso. Envolve respostas pró- e anti-inflamatórias associadas a um conjunto de alterações fisiológicas e bioquímicas que resultam em complicações da homeostase de diferentes órgãos. Pacientes que sobrevivem à sepse apresentam maior susceptibilidade a infecções secundárias com menor taxa de recuperação e maior mortalidade. Os rins são órgãos afetados durante a sepse e a insuficiência renal aguda é um comprometimento tardio que pode evoluir para insuficiência renal crônica cujo tratamento lança mão de terapias duradouras e recorrentes. Neste estudo avaliamos os efeitos do tratamento com um epímero da resolvina D1 (ATRvD1) na lesão renal de animais pós-sépticos submetidos ao estímulo secundário com alta concentração de albumina. O tratamento com ATRvD1 se deu do décimo quinto até o vigésimo primeiro dia após a indução da sepse pelo modelo de lesão e perfuração do ceco (CLP). Os animais foram tratados via intravenosa por sete dias imediatamente antes da administração intraperitoneal da albumina. No vigésimo segundo dia, os rins foram coletados para análises. Observamos que o tratamento com ATRvD1 preveniu o agravamento da lesão túbulointersticial e fibrose renal dos animais pós-sépticos que receberam o insulto secundário com albumina. A proteinúria, a apoptose e o aumento da celularidade nos glomérulos foram atenuados após o tratamento. Em adição, verificamos o efeito inibitório do ATRvD1 sobre a expressão de TGF-, colágeno do tipo III, MMP-3 e MMP-9. O tratamento atenuou a expressão de S100A4, vimentina e iNOS no tecido renal, como também, atenuou a produção das citocinas TNF- e IL1-. Em adição, a expressão gênica de TNF-, IL-10 e IFN- foi reduzida com o tratamento. Nossos resultados mostraram que ATRvD1 melhorou a função renal e inibiu a produção de mediadores envolvidos na fibrose e inflamação responsáveis pelo agravamento da lesão renal aguda em animais pós-sépticos submetidos ao insulto secundário com albumina.

Palavras-chave: Sepse; IRA; Albumina; ATRvD1; Fibrose; Inflamação

Sepsis is a metabolic and systemic inflammatory response to infection that exhibits pro- and anti- inflammatory responses associated to biochemical and physiological changes, which is associated to failure of different organs. Sepsis survival patients are often more susceptible to secondary infections with delay in the recovery and increase in the mortality. Acute kidney injury (AKI) is a common sequel of sepsis that can progress to chronic kidney disease, which requires replacement therapy. In this study we evaluated the effects of the resolvin D1 epimer (ATRvD1) on acute kidney injury of post-sepsis mice susceptible to secondary albumin kidney hit. Fifteen days after cecal ligation and puncture (CLP) procedure, surviving mice were treated intravenously with ATRvD1 and submitted to a high concentrated bovine serum albumin intraperitoneal injection, which induces AKI. ATRvD1 treatment was performed for seven days right before the bovine serum albumin injections. On day twenty-two, the kidneys were collected for analysis, while for renal function the 24 h urine was collected at day 21. We found that ATRvD1 administration attenuated renal tubule-interstitial injury and fibrosis in sepsis-surviving mice. The urinary protein and glomerular cells apoptosis and number were also reduced in ARTvD1 treated mice. In addition, ATRvD1 inhibited the expression of TGF-, collagen type III, MMP-3 and MMP-9. The treatment reduced the renal tissue overexpression of the S100A4, vimentin, and iNOS. In addition, ATRvD1 reduced pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-1 levels and downregulated TNF-, IL-10 and IFN- gene expression. Our results showed that ATRvD1 improves renal function by inhibiting the production of fibrotic and inflammatory mediators involved in the progressive AKI in post-sepsis mice subjected to second kidney albumin hit.

Palavras-chave: Sepsis; AKI;Albumin; ATRvD1; fibrosis; inflammation

Título: Estudo das vias de sinalização envolvidas na netose induzidas por L. amazonensis e proteína Amiloide.
Aluno(a): Natalia Cadaxo Rochael
Orientador(es): Prof^a Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib

As redes extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas em forma de rede e compostas por DNA, histonas e proteínas de diferentes compartimentos celulares dos neutrófilos. As NETs podem ser induzidas por diversos microrganismos, como a Leishmania, PMA, assim como fibras amiloides, moléculas proteicas insolúveis, dentre outros estímulos. A sinalização intracelular envolvida na netose é complexa e ainda não foi completamente elucidada para a maioria dos estímulos. Já foi demonstrado na literatura dois mecanismos de liberação das NETs: uma netose clássica, dependente da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela NADPH oxidase, e da descondensação da cromatina, através das enzimas peptidil arginina deaminase (PAD4), elastase e mieloperoxidase (MPO) e uma netose rápida, independente de ROS. Neste trabalho, nós demonstramos que os promastigotas de L. amazonensis induzem a netose clássica, dependente de um desequilíbrio redox celular, assim como por um mecanismo sensível à cloroamidina e atividade da elastase. Além disso, a Leishmania também induz a netose rápida que ocorre apenas 10 minutos após a interação do neutrófilo com o parasita. Nós evidenciamos que esse mecanismo rápido é dependente da atividade da elastase, mas independente da geração de ROS e cloroamidina. Outro aspecto que avaliamos foram os mecanismos de formação das NETs induzidas pela fibra amiloide A25T. Nossos resultados demonstraram que um desvio metabólico para a via das pentosefosfato (PF) é necessário para a formação das NETs induzidas pela fibra amiloide, já que a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), uma importante enzima da via das PF, fornece NADPH para a NADPH oxidase para a produção de superóxido e assim induzir a netose. Além disso, nós observamos que o ROS mitocondrial, que é independente da NADPH oxidase, não é eficaz em produzir NETs. Esses dados em conjunto fornecem novas evidências sobre como os dois mecanismos de netose, a via das PF e o metabolismo da glicose contribuem para um melhor entendimento sobre a formação das NETs induzidas pela Leishmania e pela fibra amiloide

Palavras-chave: Redes extracelulares de neutrófilos (NETs), L. amazonensis, fibra amiloide, espécies reativas de oxigênio (ROS) e via das pentose-fosfato

The neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like structures composed by DNA, histones and proteins from different neutrophils compartments. NETs can be induced by several microorganisms, such as Leishmania, PMA, as well as amyloid fibrils, insoluble protein molecules, among other stimuli. The netosis involved in intracellular signaling is complex and has not yet been completely elucidated to most stimuli. It has been shown in the literature two mechanisms for NETs release: a classic netosis, dependent on the generation of reactive oxygen species (ROS) by NADPH oxidase, and decondensation of chromatin, through enzymes peptidyl deaminase arginine (PAD4), elastase and myeloperoxidase (MPO), and a rapid netosis, ROS-independent. In this work, we demonstrate that L. amazonensis promastigotes induce the classic netosis, dependent on a cellular redox imbalance, as well as a mechanism sensitive to chloroamidine and elastase activity. Furthermore, Leishmania also induces rapid netosis occurring only 10 minutes after neutrophils interaction with the parasite. We evidenced that this rapid mechanism is dependent on elastase activity but independent of ROS generation and chloroamidine. Another aspect evaluated here were those of NETs formation mechanisms induced by amyloid fibril A25T. Our results demonstrated that a metabolic shift to pentose-phosphate (PF) pathway are required for NETs formation induced by amyloid fibril, since the glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), an important enzyme of PF pathway, provides NADPH to NADPH oxidase to produce superoxide and thus induce netosis. In addition, we observed that the mitochondrial ROS, which is NADPH oxidase independent, is not effective in producing NETs. Altogether, these data provides new evidence on how the two netose mechanisms, the PF pathway and glucose metabolism contribute to a better understanding of NETs formation induced by Leishmania and amyloid fibril.

Palavras-chave: Neutrophil extracellular traps (NETs), L. amazonensis, amyloid fibril, reactive oxygen species (ROS) and penthose-phosphate (PF) pathway.

Título: Caracterização de componentes séricos e moléculas de sinalização na resposta inflamatória induzida pelo heme
Aluno(a): Rafael Cardoso Maciel Costa Silva
Orientador(es): Prof. Marcelo Torres Bozza

O heme é uma molécula orgânica composta por um anel protoporfirínico com um átomo de ferro em seu centro. Possui atividade óxido-redutora de acordo com o estado oxidativo do átomo de ferro que o compõe. É o grupamento prostético de diversas enzimas sendo responsável pelo enlaçamento do oxigênio na hemoglobina. Conservado evolutivamente, o heme promove estresse oxidativo, através da propagação de espécies reativas de oxigênio (ROS), e induz diferentes efeitos inflamatórios, como um padrão molecular associado a dano (DAMP). Os vertebrados possuem diferentes ligantes séricos que irão interagir e mediar a detoxificação do heme liberado após eventos hemolíticos, patológicos ou fisiológicos. Esta tese foca nos efeitos inflamatórios do heme sobre macrófagos. Já foi descrito, que na ausência de ligantes séricos, o heme é capaz de ativar o receptor do tipo toll 4 (TLR4) in vitro levando a secreção de citocinas inflamatórias. Na presença de ligantes séricos, o heme não ativa TLR4, mas induz um aumento sinergístico sobre a secreção de citocinas pró-inflamatórias, quando os macrófagos são incubados concomitantemente com alguns agonistas de receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Dados in vivo corroboram ambos os resultados in vitro. Assim, após uma triagem com os diferentes ligantes séricos conhecidos do heme, identificamos a albumina como a responsável pelo bloqueio na ativação do TLR4, pelo heme, em macrófagos. De forma interessante, a albumina também se mostrou crucial para suportar o efeito sinérgico do heme após incubação com agonistas de PRRs. Além disso, estabelecemos algumas diferenças mecanísticas em relação a ambos os efeitos do heme em macrófagos. Dentre essas diferenças, vale ressaltar a participação dos microdomínios lipídicos no efeito sinérgico, mas não na ativação de TLR4 pelo heme, enquanto a endocitose parece ser importante para a ativação de TLR4 mas não para o efeito sinérgico. Evidenciamos também a ativação das quinases Lyn e PYK2, da via de Syk, pela incubação com heme tanto na presença quanto na ausência de albumina. Além de elucidar algumas questões importantes, esta tese abre diversas perspectivas para se compreender os mecanismos pelos quais o heme exerce seus efeitos inflamatórios em macrófagos.

Palavras-chave: Heme; Syk; Macrófagos; Espécies Reativas de Oxigênio; Albumina

Heme is an organic molecule composed of a protoporphyrin ring with an iron atom in its center. The oxidative state of the iron atom will determine the oxidation-reduction potentials of heme containing proteins. It is the prostetic group of many enzymes within organisms and is the main group associated to oxygen binding within hemoglobin. Conserved in almost all life forms, heme promotes oxidative stress and has many proinflammatory effects, as a damage associated molecular pattern (DAMP). As such, vertebrates express different serum ligands that are important as heme scavengers helping heme detoxification after pathological or physiological hemolysis. This thesis will focus on the inflammatory effects of heme on macrophages. It has already been described, in vitro, that heme activates Toll like receptor 4 (TLR4) on macrophages, in the absence of serum ligands. In the presence of serum ligands, heme is not able to activate TLR4, but induces a synergism over the pro-inflammatory cytokines secretion on macrophages activated with pattern recognition receptors (PRRs) agonists. In vivo datas support these two in vitro results. Through a screening with different serum ligands, we were able to determine albumin as the serum ligand responsible for the blockade of TLR4 activation and support of the synergistic effect of heme on macrophages. Besides that, we stablished some mechanistic differences associated with TLR4 activation and synergism induced by heme on macrophages. We showed that lipid rafts were important to the synergistic effects of heme, without influencing on TLR4 activation and that endocytosis had opposing effects, being important for the TLR4 activation. We demonstrated the activation, through phosphorylation, of the two kinases Lyn and Pyk2, as an activator and effector of the Syk pathway, respectively, in the presence and absence of albumin. The results presented in this thesis clarify some questions and opens different perspectives that could be important to understand the mechanisms by which heme mediates inflammatory effects on macrophages that will have systemic importance on different hemolytic diseases.

Palavras-chave: syk; Heme; Albumin

Título: Estudo da netose na leishmaniose: Aspectos moleculares e o envolvimento na resistência e susceptibilidade à infecção
Aluno(a): Thiago Soares de Souza Vieira
Orientador(es): Prof^a Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib

“Estudo da netose na leishmaniose: Aspectos moleculares e o envolvimento na resistência e susceptibilidade a infecção” Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Imunologia e Inflamação do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes – UFRJ. Neutrófilos são os primeiros leucócitos a interagirem com Leishmania durante o repaste sanguíneo do vetor e a responderem contra o parasita no sítio da infecção, porém o papel dessas células nas leishmanioses é ainda controverso. Neutrófilos liberam para o meio extracelular um esqueleto de cromatina associado a proteínas granulares e citoplasmáticas (NET), os quais juntos aprisionam e matam microrganismos através de um mecanismo de morte celular denominado netose. Foi descrito anteriormente que a interação entre neutrófilos humanos e Leishmania amazonensis resulta na liberação de NET, a qual serve de armadilha e mata o parasita. No presente trabalho, nós evidenciamos que PI3K, independente de AKT, é requerida para a liberação de NET induzida pelo parasita, sendo que as principais isoformas envolvidas são PI3Kγ e PI3Kδ, as quais funcionam através de um mecanismo dependente e independente da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), respectivamente. Demonstramos que a ativação de ERK a montante de PI3Kγ aciona a netose dependente de ROS induzida pelo parasita. A inibição de PKC reduziu significativamente a liberação de NET induzida pelo parasita. A mobilização intracelular de cálcio, regulada por PI3Kδ, representa uma via alternativa independente de ROS estimulada pelo parasita durante a netose. Finalmente, a mobilização intracelular de cálcio e a geração de ROS são os principais reguladores da netose induzida pelo parasita. Outro aspecto abordado por esse trabalho foi a eficiência dos principais mecanismos microbicidas de neutrófilos em animais resistentes e suscetíveis a infecção por L. major. Independente do status de maturação, neutrófilos de camundongos suscetíveis são mais eficientes na geração de NET, a qual é caracterizada por fibras enriquecidas em elastase e está associada com uma abundante mobilização precoce de grânulos azurofílicos antes da liberação de NET. A indução de NET por L. major é independente de NADPH oxidase e dependente de elastase. Neutrófilos de animais resistentes internalizam promastigotas mais eficientemente e tem maior impacto sobre a sobrevivência do parasita, embora gerem NETs sem toxicidade para promastigotas. A toxicidade da NET de animais suscetíveis está associada com a maior composição de elastase e promastigotas deficientes em ISP2/ISP3 mostraram-se significativamente mais suscetíveis a NET de animais suscetíveis. Portanto, os resultados apresentados aqui contribuem para o melhor entendimento da sinalização durante a netose induzida pelo parasita em neutrófilos humanos. Além disso, nós apontamos que um balanço entre a netose e a fagocitose está associado com os fenótipos de resistência e susceptibilidade a infecção por L. major

Palavras-chave: Neutrófilos; NETs; Leishmania; sinalização; fagocitose;I SP2/ISP3

“Exploring netosis on leishmaniasis: Molecular aspects of NET induction and role on resistance and susceptibility to infection” Doctorade thesis summary presented to the Imunologia e Inflamação posgraduation program at Instituto de Microbiologia Paulo de Góes – UFRJ. Neutrophils are the first leukocytes to interact and respond to the parasite at the site of inoculation, whereas the role of these cells on leishmaniasis is still controversial. Neutrophils release to the extracellular medium a chromatin scaffold associated with granular and cytoplasmic proteins, which together ensnare and kill microbes through a cell death mechanism named netosis. We have previously described that Leishmania amazonensis the release of neutrophil extracellular traps (NETs) by human neutrophils, which trap and kill the parasite. Here, we found that PI3K, independently of AKT, is required in netosis induced by the parasite and the main isoforms involved are PI3Kγ and PI3Kδ, which work in reactive oxygen species (ROS)- dependent and -independent ways, respectively. We demonstrated that activation of ERK downstream of PI3Kγ triggers ROSdependent parasite-induced netosis. Inhibition of PKC also significantly decreased parasiteinduced NET release. Intracellular [Ca2+], regulated by PI3Kδ, represents an alternative ROS-independent pathway of netosis stimulated by L. amazonensis. Finally, [Ca2+] mobilization and ROS generation are the major regulators of parasite-induced netosis. Another aspect of this work was the efficiency of the main microbicidal mechanisms of neutrophils in resistant and susceptible mice to Leishmania major. Regardless to maturation status, susceptible mice neutrophils are more efficient at generating NET, which is elastaseenriched and was found to be associated with an early abundant mobilization of azurophilic granules prior to NET release. L. major induction of NET is independent of NADPH oxidase and dependent of elastase. Resistant mice neutrophils uptake promastigotes more efficiently and control extracellular parasite survival via phagocytosis but generate NET with no toxicity to the parasite. Susceptible mice NET killing is associated with greater elastase presence and ISP2/ISP3 deficiency render significantly more parasite killing. Thus, results presented here contribute to a better understanding of the signaling behind netosis induced by interactions between Leishmania and neutrophils and point that a balance between neutrophil phagocytosis and NET generation is associated with resistance and susceptible phenotypes in L. major infection.

Palavras-chave: ISP2/ISP3; NETs; Leishmania